張 歡，王端好，陸光瑞，陳福生*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.黃淮學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，河南 駐馬店 463000；3.青援食品有限公司，山東 沂水 276400）

黃豆醬是一種以大豆和面粉為主要原料的發(fā)酵食品，營(yíng)養(yǎng)豐富且富含大豆異黃酮、多酚類(lèi)物質(zhì)、大豆皂苷等功能性成分[1]，具有抗癌、抗氧化、降血糖等生理功效[2-5]。黃豆醬的生產(chǎn)菌種常為米曲霉（Aspergillus oryzae），它主要可產(chǎn)生中性蛋白酶[6]。而黃豆醬的發(fā)酵過(guò)程處于偏酸性條件[7]，因此添加酸性蛋白酶應(yīng)該可以彌補(bǔ)米曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶的不足，促進(jìn)原料中蛋白質(zhì)分解，加速黃豆醬的生產(chǎn)，并提高其風(fēng)味。近年來(lái)，酶制劑在調(diào)味品中的應(yīng)用主要是采用復(fù)合酶制劑取代傳統(tǒng)生產(chǎn)過(guò)程中的“制曲”工序，為企業(yè)生產(chǎn)提供方便[8]。但目前對(duì)于在黃豆醬發(fā)酵過(guò)程中添加酸性蛋白酶制劑的研究鮮有報(bào)道。

酸性蛋白酶在我國(guó)食品釀造中已有較多應(yīng)用研究。唐勝球等[9]研究發(fā)現(xiàn)，添加酸性蛋白酶能夠提高黃酒出酒率，并可改善黃酒風(fēng)味；于麗萍等[10]研究表明，在醬油釀造過(guò)程中添加酸性蛋白酶可縮短醬油的釀造時(shí)間，提高其產(chǎn)量；劉鑫等[11]在食醋的釀造中添加酸性蛋白酶，發(fā)現(xiàn)可提高產(chǎn)品中氨基酸的含量，并增強(qiáng)食醋香氣成分。

本研究擬通過(guò)添加不同比例的酸性蛋白酶，以探究其對(duì)黃豆醬發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)和成熟醬醅揮發(fā)性風(fēng)味成分含量等的影響，旨在為加速黃豆醬發(fā)酵，提高其品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆醬成曲（黃豆的米曲霉培養(yǎng)物，手感曲料松軟，有彈性；外觀菌絲豐滿(mǎn)，淡黃色有曲子特有的香氣，無(wú)異味；總酸≤1.8 g/100 g；水分≤32%）：山東青援食品有限公司；酸性蛋白酶制劑（酶活100 000 U/mL）：隆科特生物科技有限公司。

甲醛（分析純）：西隴科學(xué)有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NaCl（分析純）：山東濰坊銘陽(yáng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；AgNO3（分析純）：蘇州生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MX-250HL恒溫恒濕培養(yǎng)箱：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；PHS-3C pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃豆醬釀造工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

成曲和鹽水（21.8%）按1∶1.1比例，酸性蛋白酶分別按成曲質(zhì)量的0.05%、0.15%、0.25%、0.35%，充分混合均勻后，放入玻璃罐內(nèi)，壓實(shí)并加封面鹽。封面鹽用量約為鹽水中鹽量的1/3。黃豆醬最終含鹽量約為12.6%。每組3個(gè)平行。

將盛有物料的玻璃罐放進(jìn)保溫箱內(nèi)，42 ℃恒溫發(fā)酵。15 d后翻醅，將封面鹽均勻拌入醬醅中，于33 ℃繼續(xù)恒溫發(fā)酵至30 d。每隔5 d取樣測(cè)定醬醅的pH值、總酸、氨基酸態(tài)氮和還原糖等含量，每次取樣時(shí)醬醅均需攪拌均勻。

實(shí)驗(yàn)所用成曲的蛋白酶酶活力采用福林法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果：酸性蛋白酶（225.35±15.56）U/g、中性蛋白酶（967.78±56.57）U/g。由此可知，米曲霉主要產(chǎn)中性蛋白酶。在發(fā)酵初期醬醅的酸度較低，主要是中性蛋白酶發(fā)揮水解作用，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，醬醅的酸度逐漸升高，此時(shí)酸性蛋白酶的水解能力較強(qiáng)；黃豆醬的水分含量在發(fā)酵初期為54%左右，發(fā)酵結(jié)束時(shí)為52%左右；整個(gè)發(fā)酵過(guò)程是在密閉的玻璃罐中進(jìn)行中的，水分蒸發(fā)較少。

1.3.2 黃豆醬發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)的測(cè)定

pH值和還原糖含量測(cè)定[12]：分別采用pH計(jì)和3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定醬醅的pH值和還原糖含量。

氨基酸態(tài)氮和總酸含量測(cè)定[13]：采用酸度計(jì)法和甲醛滴定法分別測(cè)定醬醅中總酸和氨基酸態(tài)氮含量。具體操作步驟參照GB 5009.235—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》中的方法。

1.3.3 黃豆醬風(fēng)味成分的測(cè)定

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrom etry，HS-SPME-GC-MS）測(cè)定成熟黃豆醬中揮發(fā)性風(fēng)味成分，具體方法參照文獻(xiàn)[14]。采用美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）11.0譜庫(kù)和WILEY09數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，選擇匹配度＞80的物質(zhì)，按照峰面積歸一化法計(jì)算揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量。

1.3.4 黃豆醬的感官評(píng)價(jià)

參照國(guó)標(biāo)GB/T 24399—2009《黃豆醬》[15]感官要求，制定感官評(píng)定表（表1），總分100分。由9名長(zhǎng)期從事制醬及檢驗(yàn)工作的人員品評(píng)和打分，比較添加和不添加酸性蛋白酶黃豆醬之間的差異。

表1 黃豆醬的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table1 Sensory score standards of soybean paste

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析及單因素方差分析，并用鄧肯復(fù)極差法（Duncan's）進(jìn)行多重顯著性差異分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸性蛋白酶對(duì)黃豆醬發(fā)酵過(guò)程中理化性質(zhì)的影響

2.1.1 總酸和pH值的變化

總酸含量是黃豆醬發(fā)酵過(guò)程的重要指標(biāo)之一[16]，因?yàn)樗犷?lèi)成分是酯化反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，一定量的有機(jī)酸可提升豆醬風(fēng)味[17]。而發(fā)酵過(guò)程中醬醅的pH值通?？刂圃?.0～6.0[18]。以不添加酸性蛋白酶的黃豆醬為對(duì)照（CK），對(duì)添加不同濃度酸性蛋白酶的黃豆醬發(fā)酵過(guò)程的總酸和pH值進(jìn)行了測(cè)定和分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 黃豆醬發(fā)酵過(guò)程中總酸含量和pH值的變化Fig.1 Changes of total acid contents and pH value of soybean paste during fermentation process

由圖1可知，在發(fā)酵前期（0～15 d）黃豆醬的總酸含量快速上升，隨后上升緩慢；pH值在發(fā)酵過(guò)程中整體呈不斷下降趨勢(shì)，且介于5.0～6.0之間。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，pH值和酸度之間具有極顯著的負(fù)相關(guān)性（CK、0.05%、0.15% 0.25%、0.35%的相關(guān)系數(shù)分別為：-0.640、-0.618、-0.595、-0.591、-0.585）（P＜0.01）。引起二者變化的主要原因是：發(fā)酵前期，在米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶和淀粉酶等的作用下，蛋白質(zhì)和淀粉迅速轉(zhuǎn)化為氨基酸、單糖和寡糖等，并進(jìn)一步在醬醅中乳酸菌、微球菌等的作用下轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸等[19]，所以醬醅總酸含量快速升高，對(duì)應(yīng)的pH值快速降低。而在發(fā)酵后期（超過(guò)15 d），由于蛋白質(zhì)和淀粉等底物濃度降低、食鹽濃度升高、pH值降低，以及發(fā)酵溫度降低等原因，乳酸菌、微球菌等產(chǎn)酸速度變得相對(duì)緩慢[20-21]，從而使得發(fā)酵后期總酸含量和pH值變化趨緩。其中發(fā)酵20 d時(shí)，醬醅的總酸含量和pH值分別有短暫和微弱的降低和升高，可能的原因是發(fā)酵15 d時(shí)，封面鹽混入醬醅中，同時(shí)發(fā)酵溫度從45 ℃降低至33 ℃，醬醅中食鹽濃度的升高和發(fā)酵溫度的降低可能使乳酸菌、微球菌等微生物存在一個(gè)適應(yīng)過(guò)程[22]。

由圖1還可看出，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中添加了酸性蛋白酶醬醅的總酸含量一直高于CK，對(duì)應(yīng)的pH值一直低于CK。這表明，添加酸性蛋白酶可促進(jìn)蛋白質(zhì)降解，促進(jìn)乳酸菌等微生物生長(zhǎng)，進(jìn)而使總酸含量升高[23]，pH值降低。添加酸性蛋白酶的豆醬在發(fā)酵過(guò)程中總酸含量與CK相比存在顯著差異（P＜0.05），但不同酸性蛋白酶添加量之間總酸含量和pH值均不存在顯著差異（P＞0.05）。

2.1.2 氨基酸態(tài)氮含量的變化

氨基酸態(tài)氮的含量是判斷發(fā)酵型豆制品品質(zhì)的主要指標(biāo)之一。而黃豆醬中氨基酸態(tài)氮含量取決于蛋白酶的水解活性[24]。添加不同量酸性蛋白酶黃豆醬發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮的變化見(jiàn)圖2。

圖2 黃豆醬發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.2 Changes of amino acid nitrogen contents of soybean paste during fermentation process

由圖2可知，在黃豆醬發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵至第5天時(shí)，醬醅中氨基酸態(tài)氮含量已經(jīng)高于GB/T 24399—2009[15]中規(guī)定的0.5 g/100 g，隨后則上升非常緩慢。發(fā)酵初期，醬醅中蛋白質(zhì)被米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶快速降解為游離氨基酸和小分子多肽，使醬醅中氨基酸態(tài)氮含量升高[16]；之后由于鹽濃度和酸度的升高使蛋白酶活力下降，氨基酸態(tài)氮生成量減少，而且一些微生物需要利用其作為氮源進(jìn)行生長(zhǎng)[25]，導(dǎo)致醬醅中氨基酸態(tài)氮的含量增加緩慢。而且發(fā)酵過(guò)程中添加酸性蛋白酶發(fā)酵黃豆醬的氨基酸態(tài)氮含量始終高于CK。因此可知，添加酸性蛋白酶發(fā)酵黃豆醬可以提高醬醅中氨基酸態(tài)氮的含量，尤以0.05%的添加效果最為顯著（P＜0.05）。

2.1.3 還原糖含量的變化

發(fā)酵過(guò)程中，原料中的淀粉在米曲霉產(chǎn)生的淀粉酶、糖化酶的作用下水解為還原糖，還原糖可進(jìn)一步對(duì)醬的色、香、味產(chǎn)生影響[26-27]。不同酸性蛋白酶添加量的黃豆醬發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量變化見(jiàn)圖3。

圖3 黃豆醬發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量的變化Fig.3 Changes of reducing sugar contents of soybean paste during fermentation process

由圖3可知，在黃豆醬發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵至第10天時(shí)醬醅中還原糖含量已達(dá)到最高值，隨后緩慢降低。發(fā)酵初始（＜10 d），米曲霉產(chǎn)生的淀粉酶和糖化酶將原料中的淀粉快速水解產(chǎn)生還原糖[28]，使得還原糖含量快速升高；而發(fā)酵后期（＞10 d），隨著淀粉底物的減少，以及部分還原糖與氨基酸結(jié)合形成色素[29]，導(dǎo)致還原糖含量緩慢下降。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，與CK相比，酸性蛋白酶的添加對(duì)還原糖含量變化無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

2.2 酸性蛋白酶的添加對(duì)黃豆醬風(fēng)味成分的影響

據(jù)報(bào)道，發(fā)酵黃豆醬中的風(fēng)味成分主要包括酸類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、酯類(lèi)、呋喃類(lèi)、吡嗪類(lèi)等[30]。采用HS-SPMEGC-MS分析了不同酸性蛋白酶添加量的成熟黃豆醬（發(fā)酵至30 d）中風(fēng)味成分，具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，黃豆醬中的風(fēng)味成分主要是醛類(lèi)、酯類(lèi)、醇類(lèi)和酸類(lèi)。其中醛類(lèi)物質(zhì)的相對(duì)含量最高，酯類(lèi)次之。醛類(lèi)具有清香、果香和堅(jiān)果香的芳香特質(zhì)[31]；酯類(lèi)化合物是構(gòu)成黃豆醬香氣主體成分，也可增強(qiáng)其他風(fēng)味化合物氣味，緩和黃豆醬咸味，并對(duì)黃豆醬不良?xì)馕逗痛碳ば詺馕队幸欢ㄒ种谱饔肹26]；醇類(lèi)可以賦予黃豆醬特殊香氣，也可以和酸類(lèi)成分一起成為酯化反應(yīng)底物[32]。主要風(fēng)味物質(zhì)中含量較高的化合物包括苯甲醛、苯乙醛、己醛、3-糠醛、棕櫚酸乙酯、1-辛烯-3-醇和2-乙基己酸。

表2 添加不同量酸性蛋白酶5種黃豆醬的揮發(fā)性化合物比較Table2 Comparison of volatile flavor compounds of 5 kinds of soybean paste with different acid protease addition

續(xù)表

續(xù)表

與CK相比，添加酸性蛋白酶的黃豆醬中，酸類(lèi)、酯類(lèi)和醇類(lèi)的含量更高且差異顯著（P＜0.05）。其主要原因可能是：大豆蛋白在蛋白酶的作用下逐漸降解為肽和氨基酸，是黃豆醬揮發(fā)性風(fēng)味成分的重要風(fēng)味前提[33]，而米曲霉產(chǎn)生的中性蛋白酶，可將蛋白質(zhì)分解成可溶性氮，無(wú)法產(chǎn)生游離氨基酸，需要在酸性蛋白酶的作用下才能將肽類(lèi)進(jìn)一步分解成氨基酸[34]。添加酸性蛋白酶有助于氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)和Strecker降解，從而增加風(fēng)味物質(zhì)的含量[35]。而且不同添加量之間揮發(fā)性風(fēng)味成分也會(huì)存在一些差異（P＜0.05），但揮發(fā)性風(fēng)味成分的含量并未隨著酸性蛋白酶添加量的逐漸增加而增多。

2.3 感官評(píng)價(jià)

成熟黃豆醬的感官評(píng)分結(jié)果如表3所示。

由表3可知，發(fā)酵結(jié)束后成熟黃豆醬的感官性質(zhì)良好，未出現(xiàn)腐敗變質(zhì)等不良現(xiàn)象。酸性蛋白酶的添加增強(qiáng)了醬的香氣，促進(jìn)了原料中蛋白質(zhì)的水解，有較多醬汁，體態(tài)良好。從整體評(píng)分結(jié)果可以看出，添加酸性蛋白酶的醬品質(zhì)更佳。

表3 酸性蛋白酶添加量對(duì)黃豆醬感官評(píng)分的影響Table3 Effect of acid protease addition on sensory scores of soybean paste

3 結(jié)論

在黃豆醬發(fā)酵過(guò)程中添加不同量的酸性蛋白酶（0.05%、0.15%、0.25%、0.35%，占成曲的比例），可彌補(bǔ)成曲中酸性蛋白酶的不足，促進(jìn)黃豆醬原料中蛋白質(zhì)的分解，從而提高醬醅中氨基酸態(tài)氮的含量，其中0.05%添加量的提升效果最好并有顯著性差異（P＜0.05）；而且添加酸性蛋白酶顯著提高了醬醅中揮發(fā)性酯類(lèi)、醇類(lèi)和酸類(lèi)成分含量及黃豆醬的感官品質(zhì)（P＜0.05）。但揮發(fā)性風(fēng)味成分的含量并未隨著酸性蛋白酶添加量的逐漸增加而增多。所以此次實(shí)驗(yàn)得出添加0.05%的酸性蛋白酶發(fā)酵黃豆醬為最佳。

本次實(shí)驗(yàn)中酸性蛋白酶的最低添加量為0.05%，其發(fā)酵效果最佳，后期實(shí)驗(yàn)可嘗試添加更低量的酸性蛋白酶，探究其發(fā)酵效果，以節(jié)約生產(chǎn)成本。