舒學香，周 文，2 ，吳 霞，隋 明，唐賢華

（1.四川工商職業(yè)技術(shù)學院 酒類與食品工程系，四川 都江堰 611830；2.四川大學 輕工科學與工程學院，四川 成都 610065）

獼猴桃也稱藤梨、奇異果、毛梨等。因其獨特的風味，富含維生素C，被譽為“水果之王”[1]，中國是獼猴桃屬植物的原產(chǎn)地，獼猴桃資源極其豐富[1]，截至2018年3月，中國獼猴桃種植面積共24.2萬hm2，結(jié)果面積15.8萬hm2，產(chǎn)量243萬t，產(chǎn)量和種植面積均居世界第一[2]。其中四川省的獼猴桃種植面積達到2.97萬hm2，年產(chǎn)值達11億元，位列全國第二名。四川都江堰由于土壤、氣候環(huán)境和水源等條件非常適合種植獼猴桃，使都江堰成為了全國最早引種獼猴桃成功的地區(qū)，并且都江堰獼猴桃獲得國家地理標志產(chǎn)品保護[3]。目前獼猴桃銷售方式仍以鮮銷為主，然而由于貯藏技術(shù)水平不高，導致大量積壓、腐爛，給產(chǎn)地獼猴桃銷售造成困境，加之每年有大量次果鮮銷困難，因此，加大果實加工產(chǎn)品的開發(fā)，對于獼猴桃資源的利用有很大的意義和前景。

獼猴桃果酒是以獼猴桃果汁（漿）為原料，經(jīng)完全或部分發(fā)酵而釀制成的發(fā)酵酒[4]。開發(fā)獼猴桃果酒順應(yīng)了現(xiàn)代酒類的4大轉(zhuǎn)變方向，即糧食酒向果酒轉(zhuǎn)變，高度酒向低度酒轉(zhuǎn)變，低檔酒向高檔酒轉(zhuǎn)變，蒸餾酒向發(fā)酵酒轉(zhuǎn)變，具有較好的發(fā)展前景。目前，已有很多關(guān)于獼猴桃酒釀造工藝的研究[5-7]，都江堰青城山道家也有采用傳統(tǒng)工藝釀制的獼猴桃酒，因其在天下第五洞天中釀制，取名為洞天乳酒，譽為“青城四絕”之一[3]。但是這些使用天然酵母或葡萄酒釀造酵母釀造獼猴桃酒會導致其香味不突出、獼猴桃風味不典型，嚴重影響了獼猴桃酒的品質(zhì)，限制了獼猴桃酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[8]。因此，篩選獼猴桃果酒釀造專用酵母勢在必行，近年來已有研究團隊開展了相關(guān)研究，開發(fā)了幾種篩選方法并篩選到了一些獼猴桃酒釀造專用酵母，通過應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵能力較強，并能較好的保留獼猴桃的風味[9-11]，但獼猴桃品種眾多，全世界獼猴桃屬植物共有54個種，21個變種[1]，已篩出的這些酵母不一定適合所有品種獼猴桃酒的釀造。本研究以都江堰紅陽獼猴桃為試驗原料，以發(fā)酵能力為主要指標，從富含酵母的果皮、果園土壤中篩選獼猴桃果酒釀造專用酵母，以期深化紅陽獼猴桃加工應(yīng)用，提高產(chǎn)品附加值，解決鮮果擠壓、滯銷、腐爛、損壞等問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與試劑

紅陽獼猴桃：都江堰市聚源鎮(zhèn)市售；獼猴桃果園土壤：都江堰市聚源鎮(zhèn)；偏重亞硫酸氫鉀、碳酸鈣（分析純）：成都金山化學試劑有限公司；果膠酶（30 000 U/g）、明膠（生化試劑）：成都市科龍化工試劑廠；安琪葡萄酒高活性干酵母BV818：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基（獼猴桃果汁培養(yǎng)基）：成熟的獼猴桃分選、洗凈、去皮，擠出漿汁，加入果膠酶100 mg/L，密封室溫酶解12 h。酶解結(jié)束后用4層紗布過濾，濾液中加入偏重亞硫酸鉀160 mg/L，放入4 ℃冰箱，備用。

豆芽瓊脂培養(yǎng)基：稱取一定量的黃豆芽，加入10倍的水，煮沸后小火熬煮30 min，用紗布濾掉豆芽渣，補足蒸發(fā)的水分，制得濃度10%的豆芽汁。在豆芽汁中加入5%的葡萄糖，2%的瓊脂粉，加熱并緩慢攪拌使瓊脂粉融化。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱、TH2-98A型恒溫搖床：上海齊欣科學儀器有限公司；LH129425型手持糖度儀：成都市青羊聯(lián)合光學儀器成套部；pH/Ion510酸度計：賽飛（中國）有限公司；Nikon E100型數(shù)碼顯微鏡：江南永新有限公司；2720 thermal cycler型聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國Applied Biosystems公司；UV-5100型紫外-可見分光光度計：上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的富集

稱取5 g獼猴桃果園土壤或獼猴桃果皮于50 mL無菌生理鹽水中混勻制成樣品稀釋液。按照無菌操作的要求，將2 mL樣品稀釋液接種到50 mL富集培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)2～3 d，制得酵母富集液。富集過程中，每隔6 h用分光光度計測其在波長600 nm下的吸光度值。

1.3.2 酵母菌株的分離

按照無菌操作的要求，將酵母菌富集液用無菌生理鹽水逐級進行10倍梯度稀釋，取10-6、10-7、10-8三個梯度稀釋液各0.1 mL，分別涂布于豆芽瓊脂培養(yǎng)基平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d。

1.3.3 酵母菌株的初篩

待分離平板上菌落長出后，根據(jù)菌落形態(tài)挑取不同菌落特征的單菌落劃線接種于豆芽瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d，待菌落長出后，觀察細胞形態(tài)，將符合酵母特性的初篩菌株試管斜面放入4 ℃冰箱保藏。

1.3.4 酵母菌株的復篩

將初篩得到的菌株挑取2環(huán)接種于10 mL豆芽汁培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)至波長600 nm處的吸光度值為0.8。在250 mL三角瓶中裝入200 mL獼猴桃果汁，接入10 mL初篩菌株培養(yǎng)液，用止回閥封口，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置發(fā)酵，發(fā)酵的過程中觀察發(fā)酵液起泡產(chǎn)生情況、果渣分離情況，并測定發(fā)酵液糖度、酒精度、CO2質(zhì)量損失的變化，結(jié)合感官評定，篩選優(yōu)良的菌種。

1.3.5 獼猴桃果酒的釀造與主要指標的檢測方法

參考文獻[13]方法，進行獼猴桃果酒的釀造，主要指標的測定方法如下：

糖度：使用糖度儀，按照其使用說明進行檢測。

CO2質(zhì)量損失：稱量接種時發(fā)酵液的質(zhì)量（M0），在發(fā)酵過程中稱量發(fā)酵液的質(zhì)量（Mn），CO2質(zhì)量損失（g）=M0-Mn。

酒精度、感官評定參照國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[12]進行。

1.3.6 感官評分標準

感官評分由5名評分人員參照參考文獻[13]中的標準進行。

1.3.7 菌株的鑒定

形態(tài)及生理生化鑒定：根據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊》[14]對篩選出的優(yōu)勢菌株進行形態(tài)學觀察，選擇合適的指標進行生理生化鑒定。

分子生物學鑒定：采用Ezup柱式真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒，按照其說明書提取菌株的總DNA，以其作為模板采用NL1、NL4通用引物PCR擴增菌株26S rDNA D1/D2區(qū)。擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，位置正確的條帶切膠后用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化，純化后的PCR擴增產(chǎn)物委托上海生工生物工程公司進行測序。測序結(jié)果提交到美國國家生物信息中心（national center for biotechnology information，NCBI），運用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索。通過搜索比對，選取相似度較高的菌株，下載其26S rDNA D1/D2區(qū)序列，與篩出的菌株序列一起用MEGA-X軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.8 獼猴桃酒的香氣成分分析

將菌株T-13用于獼猴桃酒的發(fā)酵，并以未接種酵母的獼猴桃果汁和接種市售葡萄酒專用酵母發(fā)酵的獼猴桃原酒作為參照，采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）法結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatograph-massspectrometer，GC-MS）儀分析其香氣成分。發(fā)酵方法和HS-SPME-GC-MS條件按照參考文獻[13]進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 富集過程微生物數(shù)量的變化

將獼猴桃果皮和獼猴桃果園土壤分別制成稀釋液，添加到獼猴桃果汁中富集培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中測其OD600nm值，以監(jiān)測微生物數(shù)量變化，分析結(jié)果見圖1。

圖1 富集培養(yǎng)過程中的微生物生長曲線Fig.1 Growth curve of microorganisms during enrichment culture

由圖1可知，獼猴桃果皮和獼猴桃果園土壤微生物富集過程中，微生物數(shù)量的變化規(guī)律一致。18 h以內(nèi)是延滯期，微生物在適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境為快速繁殖做準備，因此這一時期微生物數(shù)量增長緩慢；18～48 h為對數(shù)生長期，此時微生物數(shù)量快速增長，同時培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)被快速消耗；48 h以后，由于營養(yǎng)物質(zhì)的減少，微生物的生長進入平穩(wěn)期和衰亡期，微生物細胞活力減弱，死亡數(shù)不斷增加。為了更多、更好地篩選到強壯的酵母，選擇處于對數(shù)期（富集42～48 h）的富集培養(yǎng)液開展后續(xù)工作。

2.2 菌株初篩

富集培養(yǎng)液稀釋涂布于分離平板上，待菌落長出后，根據(jù)菌落特征挑選出28株可能是酵母的菌株。將它們劃線培養(yǎng)后觀察菌落特征和細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)4株符合酵母菌落和形態(tài)特征[15]的菌株T-8、T-11、T-13、P-12，其菌落特征和細胞形態(tài)結(jié)果如表1所示。

表1 初篩菌株的菌落特征和細胞形態(tài)Table1 Colony characteristics and cell morphology of primary screening strains

2.3 菌株復篩

2.3.1 不同菌株對發(fā)酵過程糖度變化的影響

降糖速度是指示菌株發(fā)酵性能的重要指標，在同等條件下，希望菌株的降糖速度更快，這標志著菌株發(fā)酵速度更快，發(fā)酵啟動時間更短?？焖侔l(fā)酵有利于防止發(fā)酵過程中感染雜菌，對保障獼猴桃酒的穩(wěn)定性有較大的作用。由圖2可知，篩選出的T-8、T-11、T-13三株菌降糖速度較快，優(yōu)于菌株P(guān)-12，且篩選出的4株菌降糖速度都快于市售果酒酵母，說明獼猴桃果園環(huán)境中的天然酵母可能更適合獼猴桃果汁的發(fā)酵。從最終糖度來看，篩出的4株菌及市售果酒酵母都在發(fā)酵開始約48 h時將糖度降至6°Bx左右，之后糖度幾乎不再下降，說明這幾株菌在最終發(fā)酵度方面基本沒有區(qū)別，總糖都降了10°Bx左右，都能夠滿足獼猴桃酒發(fā)酵的需求。

圖2 發(fā)酵過程中的糖度變化Fig.2 Changes of sugar degree during fermentation process

2.3.2 不同菌株對發(fā)酵過程CO2質(zhì)量損失的影響

CO2質(zhì)量損失也是評價菌株發(fā)酵力的重要指標[16]，酵母在發(fā)酵獼猴桃汁中的糖分產(chǎn)生酒精的同時也會產(chǎn)生CO2，CO2通過止回閥排出三角瓶，因此CO2質(zhì)量損失越大說明酵母利用的糖越多，發(fā)酵力越強。從圖3可以看出，篩選到的4株菌發(fā)酵獼猴桃汁的能力都強于市售果酒酵母，同時發(fā)現(xiàn)測定CO2質(zhì)量損失反應(yīng)出的各菌株發(fā)酵能力規(guī)律與測定糖度反應(yīng)出的規(guī)律是一致的，這進一步證實了獼猴桃果園環(huán)境中的天然酵母可能更適合獼猴桃果汁的發(fā)酵的結(jié)論。通過CO2質(zhì)量損失分析還可以更清晰地看到菌株T-13的發(fā)酵能力是篩選出的4株菌中最強的，CO2質(zhì)量損失為13 g（6.13%），發(fā)酵速度最快且最終發(fā)酵度也更高。

圖3 發(fā)酵過程中CO2質(zhì)量損失的變化Fig.3 Changes of CO2 mass lost during fermentation process

2.3.3 不同菌株對發(fā)酵過程酒精度變化的影響

從圖4可以看出，獼猴桃果汁發(fā)酵過程中，酒精度的變化規(guī)律與糖度變化、CO2質(zhì)量損失變化的規(guī)律完全一致。說明從三個評價菌株發(fā)酵力的主要指標都能看出，篩選出的4個菌株相對于市售果酒酵母都更適合于獼猴桃果汁的發(fā)酵，且篩選出的菌株T-13的發(fā)酵能力是最強的，發(fā)酵72 h后所產(chǎn)獼猴桃果酒酒精度可以達到9.8%vol。

圖4 發(fā)酵過程中酒精度的變化Fig.4 Changes of alcohol content during fermentation process

2.4 感官評價

將篩選出的4株菌與市售果酒專用酵母發(fā)酵試驗獲得的原酒按照感官評分標準進行感官評價，其結(jié)果如表2所示。

表2 不同菌株發(fā)酵獼猴桃酒感官評價結(jié)果Table2 Results of sensory evaluation of kiwi fruit wine fermented by different strains

通過感官評價結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株T-8、T-11、P-12及市售果酒酵母發(fā)酵所得的原酒在澄清度、顏色、香氣、口感等各個方面都較為相似，而菌株T-13在各方面的評價要優(yōu)于其他菌株。通過感官評分可以分析出菌株T-11和P-12發(fā)酵的獼猴桃原酒感官質(zhì)量較差，菌株T-8與市售果酒酵母接近，發(fā)酵的獼猴桃原酒感官質(zhì)量一般，菌株T-13發(fā)酵的獼猴桃原酒感官質(zhì)量最好。說明篩選到的菌株T-13最適合用于釀造獼猴桃酒，能較好地保留獼猴桃獨特的香氣和滋味，發(fā)酵出的原酒具有典型的獼猴桃香氣。

2.5 菌株T-13的鑒定

2.5.1 形態(tài)學觀察

前期發(fā)酵力測試和發(fā)酵試驗感官評分均表明菌株T-13最適合用于獼猴桃果汁的發(fā)酵，因此開展了菌株T-13的鑒定工作。將T-13菌株在豆芽瓊脂固體平板培養(yǎng)基上劃線，28 ℃培養(yǎng)48 h后觀察其菌落形態(tài)，菌株T-13的菌落形態(tài)、細胞形態(tài)、美蘭染色結(jié)果見圖5。

圖5 菌株T-13的菌落形態(tài)（A）和細胞形態(tài)（B）Fig.5 Colony (A) and cell (B) morphology of strain T-13

由圖5A可知，菌落呈白色，表面光滑濕潤不透明，單個菌落呈較規(guī)則的圓形并突出于培養(yǎng)基生長，單菌落中心有白色凸起，邊緣整齊，易挑取，符合酵母菌的典型菌落形態(tài)特征[17-18]。由圖5B可知，菌株T-13培養(yǎng)48 h后進行美蘭染色在光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)細胞呈卵圓形，無菌絲，同樣是酵母的典型細胞形態(tài)[18]，通過美蘭染色還可以看出，培養(yǎng)48 h的酵母細胞活性較強，絕大多數(shù)細胞是活細胞。

2.5.2 生理生化鑒定

菌株T-13的生理生化測試結(jié)果見表3。根據(jù)生理生化鑒定結(jié)果，結(jié)合菌株的菌落形態(tài)和細胞形態(tài)，查閱《酵母菌的特征與鑒定手冊》[14]，初步判定菌株T-13為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

表3 菌株T-13的生理生化鑒定結(jié)果Table3 Results of physiological and biochemical identification of strain T-13

2.5.3 分子生物學鑒定

提取菌株T-13的基因組DNA，以其為模板用NL1、NL4通用引物進行26S rDNA D1/D2區(qū)擴增，擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結(jié)果如圖6。

圖6 菌株T-13 26S rRNA PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.6 Results of agarose gel electrophoresis of 26S rDNA PCR amplification product of strain T-13

PCR擴增產(chǎn)物純化后委托上海生工生物工程公司進行測序。測序結(jié)果提交NCBI，運用BLAST工具在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源序列比對，選取相似度較高的菌株，下載其26S rDNA D1/D2區(qū)基因序列，用MEGA-X軟件中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，菌株T-13與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）聚到一支，它們的親緣關(guān)系最近，序列相似度為100%。結(jié)合形態(tài)觀察和生理生化鑒定，確定菌株T-13為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

圖7 基于26S rDNA序列菌株T-13的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of strain T-13 based on 26S rDNA gene sequences

2.6 獼猴桃酒的香氣成分分析

采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)分析菌株T-13發(fā)酵的獼猴桃原酒、市售果酒釀造專用酵母發(fā)酵的獼猴桃原酒以及獼猴桃果汁中的香氣成分，其GC-MS分析總離子流色譜圖見圖8。

從圖8可知，菌株T-13發(fā)酵的獼猴桃原酒與獼猴桃果汁的香氣成分極其相似，出峰位置幾乎完全一樣，說明菌株T-13發(fā)酵能更好地保持獼猴桃果汁原有的風味特征。相比較而言，市售果酒酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了一些新的代謝產(chǎn)物，也有一些獼猴桃汁中存在的香氣成分消失，說明發(fā)酵作用帶來了一些風味上的改變。采用面積歸一化法，定量分析檢測到的主要香氣成分對應(yīng)峰面積計算相對含量，其結(jié)果如表4所示。

圖8 酵獼猴桃汁及獼猴桃酒的香氣成分的GC-MS總離子流色譜圖Fig.8 Total ion flow chromatography of aroma components in kiwi fruit juice and kiwi fruit wine analyzed by GC-MS

由表4可知，相對于市售果酒酵母，菌株T-13發(fā)酵制得的獼猴桃原酒中香氣成分組成與獼猴桃汁基本相同，說明其保留了獼猴桃原有的風味特征。但是經(jīng)過菌株T-13發(fā)酵后各香氣成分的占比發(fā)生了一定的變化，主要表現(xiàn)在3-甲基-1-丁醇、乙酸苯乙酯的大量減少，以及丁酸乙酯、苯乙醇、乙基9-癸烯酸酯的大量增加。3-甲基-1-丁醇俗稱異戊醇，是雜醇油的重要組成部分[19]，過多的雜醇油是造成飲酒上頭的重要原因[20]，所以3-甲基-1-丁醇的減少對酒質(zhì)有一定益處。乙酸苯乙酯是常見的風味物質(zhì)，具有花香、蜜香、果香氣味[21-22]，可以看到菌株T-13發(fā)酵會導致獼猴桃酒中來自于乙酸苯乙酯的香氣減少。丁酸乙酯具有強烈的果香味，對獼猴桃香氣的貢獻最大[23]，說明菌株T-13的發(fā)酵作用能夠使酒中的獼猴桃香氣更加突出。苯乙醇是酵母發(fā)酵獼猴桃酒的重要香氣成分，能夠賦予獼猴桃酒獨特的花香[24]，經(jīng)菌株T-13發(fā)酵后獼猴桃酒中苯乙醇含量顯著增加，說明該菌對獼猴桃酒的風味形成有一定的好處。乙基9-癸烯酸酯也是發(fā)酵果酒中含量較高的一種酯類[25]，但目前少有見到其風味特征的有關(guān)報道，因此尚無法判斷其對獼猴桃酒香氣影響的利弊。

表4 酵獼猴桃汁及獼猴桃酒的香氣成分對照Table4 Comparison of aroma components in kiwi fruit juice and kiwi fruit wine fermented with different yeasts

3 結(jié)論

經(jīng)過富集培養(yǎng)、初篩和復篩，從獼猴桃果園土壤中篩選到了一株非常適合獼猴桃果汁發(fā)酵生產(chǎn)獼猴桃發(fā)酵酒的酵母，命名為T-13。通過降糖能力、CO2質(zhì)量損失和產(chǎn)酒精能力測試發(fā)現(xiàn)該菌株具有很強的發(fā)酵能力，在用于獼猴桃果汁的發(fā)酵時，其發(fā)酵性能明顯優(yōu)于市售果酒酵母釀造酵母。結(jié)合形態(tài)學鑒定、生理生化鑒定和分子學鑒定，證實該菌株屬于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。將菌株T-13用于發(fā)酵試驗，對獲得的獼猴桃原酒進行感官評價和香氣成分分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)菌株T-13發(fā)酵產(chǎn)生的獼猴桃原酒質(zhì)量較優(yōu)，具有典型的獼猴桃香氣，是適合于獼猴桃酒釀造的專用酵母。