王曉萌，高 潔，韓張鵬，張 卓，劉 軒，宋新宇

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

開菲爾是原產(chǎn)自高加索地區(qū)的一種傳統(tǒng)含酒精發(fā)酵乳飲料，且風(fēng)味和口感獨特，有“發(fā)酵乳制品中之香檳”的美譽[1]，因而深受廣大國家和地區(qū)消費者的喜愛。高加索乳桿菌（Lactobacillus kefiri）是開菲爾發(fā)酵乳中的主要組成成分之一[2]，也是公認安全的乳桿菌[3]，具有悠久的食用歷史，在益生菌的臨床使用上起到指導(dǎo)作用[3]。近年來，對L.kefiri功能活性研究較多，特別是抗氧化活性、免疫調(diào)節(jié)活性、降低膽固醇和調(diào)節(jié)腸道菌群活性等?；谝延醒芯浚疚木C述了L.kefiri主要功能活性研究進展，并從作用途徑或物質(zhì)基礎(chǔ)的角度進行歸納總結(jié)，以期為L.kefiri的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 抗氧化活性

乳桿菌的抗氧化性已被諸多體內(nèi)外試驗證實，抗氧化活性也是多種功能活性的作用的基礎(chǔ)機制。不同的乳桿菌具抗氧化性強弱不同[4]，具有抗氧化活性的乳桿菌將有潛力開發(fā)為益生菌資源。研究表明，L.kefiri具有顯著的抗氧化活性。

1.1 體內(nèi)抗氧化研究

體內(nèi)抗氧化研究實驗通常以小鼠作為實驗動物，使小鼠口服L.kefiri作為干預(yù)物展開實驗，最終檢測小鼠相關(guān)代謝指標(biāo)或身體機能指標(biāo)作為判斷抗氧化能力的依據(jù)。GHONEUM M等[5]以32只來自埃及亞歷山大大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗室的小鼠口服一種主要由L.kefiri組成的天然混合物（一種新型開菲爾制品）（probioticsfermentation technology，PFT），測定了小鼠肝臟、大腦和血清部位的總抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAC）和抗羥基自由基（anti-hydroxyl radical，AHR）等指標(biāo)，研究結(jié)果表明，PFT影響小鼠的氧化還原穩(wěn)態(tài)，逆轉(zhuǎn)了TAC和AHR含量的下降，膳食中添加PFT可有效調(diào)節(jié)小鼠的年齡相關(guān)氧化應(yīng)激并增強小鼠抗氧化水平。ERDOGAN F S等[6]以BALB/c小鼠作為實驗動物測定L.kefiri的抗氧化性能，測定結(jié)果表明，血清總抗氧化狀態(tài)（total antioxidant status，TAS）增高、總氧化狀態(tài)（total oxidant status，TOS）降低、丙二醛（malondialdehyde，MDA）降低和髓體過氧化物酶（myelo-peroxidase，MPO）降低，L.kefiri體現(xiàn)了一定的抗氧化能力。

1.2 體外抗氧化研究

體外抗氧化研究試驗主要是通過測定自由基清除率前后變化等重要試驗指標(biāo)，評估L.kefiri的抗氧化能力大小，可實現(xiàn)更簡單、更方便和更詳細的分析，但由體外實驗研究的結(jié)果推知到完整生物體的扔具有挑戰(zhàn)性[7]。AYRANC U G等[8]采用L.kefiri蛋白酶水解消化酪蛋白、面筋和大豆蛋白，這些大的蛋白質(zhì)可能被水解成更短的肽或氨基酸，其抗氧化活性是通過產(chǎn)酶和食品發(fā)酵的過程來實現(xiàn)的。實驗表明，L.kefiri發(fā)酵能顯著促進酪蛋白的水解并提高1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除和還原力，從而提高食物蛋白抗氧化能力。趙彤等[4]對L.kefiriKL22進行自由基清除實驗，同時測定滅活菌體和活性菌體，當(dāng)菌體濃度為107CFU/mL時，菌株KL22對DPPH·、O2-·、·OH均有不同程度的清除作用，其中菌株KL22對的DPPH自由基清除率最高，活菌組可達到70.34%，由此可見L.kefiriKL22具有較強的抗氧化能力。

2 免疫調(diào)節(jié)活性

免疫調(diào)節(jié)能力是乳桿菌常見的功能活性，乳桿菌對機體免疫具有雙向調(diào)節(jié)活性，既能夠上調(diào)增強免疫力，也能夠下調(diào)抑制過度免疫[9]?；谝延醒芯浚琇.kefiri已經(jīng)被證實具有良好的免疫調(diào)節(jié)能力，L.kefiri菌體和活性代謝產(chǎn)物免疫調(diào)節(jié)研究的研究對象、實驗方法及相關(guān)結(jié)論見表1。

表1 高加索乳桿菌菌體和活性代謝產(chǎn)物免疫調(diào)節(jié)能力研究進展Table1 Research progress on immunomodulatory ability of Lactobacillus kefiri and active metabolites

2.1 菌體免疫調(diào)節(jié)能力

L.kefiri可以通過自身菌體調(diào)節(jié)免疫，L.kefiri在抗過敏和免疫調(diào)節(jié)及保護方面有著重要作用，HONG S W等[10]研究表明，使雌性BALB/c小鼠口服分離自開菲爾顆粒的熱滅活的馬乳酒樣乳桿菌（Lactobacillus kefiranofaciens）和L.kefiri，可使輔助性Th1細胞產(chǎn)生細胞因子的水平升高，Th2細胞產(chǎn)生細胞因子的水平降低，Th1/Th2平衡向Th1主導(dǎo)地位傾斜，并通過減少活化CD19+B細胞，補體系統(tǒng)和成分的下調(diào)等作用有效抑制機體對卵清蛋白（ovalbumin，OVA）的免疫球蛋白IgE的產(chǎn)生，說明L.kefiri在抗Ι型過敏活性中發(fā)揮著重要作用。肖雪筠等[11]的研究通過擴大培養(yǎng)和活力測定，發(fā)現(xiàn)L.kefiri能夠部分緩解環(huán)磷酰胺對小鼠免疫抑制作用，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，從而調(diào)節(jié)體液免疫和細胞免疫平衡。GHONEUM M等[12]提及L.kefiri可選擇性的誘導(dǎo)人胃腺癌細胞系（gastric cancer cells，AGS）和小鼠乳腺癌細胞系（breast cancer cells）4T1凋亡，即L.kefiri通過膜穿孔機制誘導(dǎo)癌細胞發(fā)揮凋亡作用，可達到凋亡率66.3%的峰值，L.kefiri可以誘導(dǎo)人多藥耐藥（multidrugresistant，MDR）髓系白血?。╩yeloidleukemia）細胞HL60/AR凋亡，凋亡率可達67.5%[13]，從而起到免疫調(diào)節(jié)和保護作用。

2.2 活性代謝產(chǎn)物免疫調(diào)節(jié)能力

菌體細胞的活性代謝產(chǎn)物能夠刺激機體產(chǎn)生各類與免疫相關(guān)的細胞因子，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫的作用[14]，L.kefiri作為乳桿菌的重要組成成分，并有成為益生菌的潛力，其活性代謝產(chǎn)物是L.kefiri形成免疫機制的重要方式之一。

2.2.1 S層蛋白的免疫調(diào)節(jié)能力

L.kefiri可以通過S層蛋白（S-layer protein，SLP）來調(diào)節(jié)免疫，SLP是一種由亞基組成的（糖）蛋白包膜，亞基自組裝形成一個二維晶格，覆蓋在不同種類的細菌和古細菌的表面[15]，乳桿菌SLP具有誘導(dǎo)巨噬細胞活化應(yīng)答、影響菌體表面性質(zhì)、參與菌體黏附腸道過程和抑制病原菌對腸道入侵等作用[16]。MALAMUDM等[17]實驗中在Ca2+作用下與只有脂多糖處理的巨噬細胞相比，脂多糖和SLP孵育的巨噬細胞產(chǎn)生的IL-6、CD40和CD86水平更高，這說明SLP上存在的末端聚糖可協(xié)同脂多糖誘導(dǎo)成熟巨噬細胞的免疫刺激活性，進一步證明L.kefiri的S層糖蛋白以Ca2+依賴的方式增強了脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細胞應(yīng)答。此外，SLP能夠通過巨噬細胞誘導(dǎo)的C型凝集素受體對聚糖部分識別并觸發(fā)抗原呈遞細胞的成熟來增強OVA的特異性免疫應(yīng)答。GOLOWCZYC M A等[18]研究SLP對L.kefiri和解脂酵母（Saccharomyces lipolytica）間的共聚作用的影響，發(fā)現(xiàn)氯化鋰處理去除SLP后，二者間的共聚率明顯下降，說明SLP在一定程度上決定了菌體黏附力的大小，間接調(diào)控免疫調(diào)節(jié)作用的強弱。MALAMUD M等[19]利用野生型和C57BL/6-Tg（TcraTcrb）425Cbn/J（OT-II）小鼠巨噬細胞RAW 264.7模型表明不同L.kefiri菌株的糖基化SLP可以通過識別其多糖誘導(dǎo)抗原呈遞細胞的活化。GOLOWCZYC M A等[20]經(jīng)驗證，沙門氏菌（Salmonella enterica）與可凝集酸乳桿菌共孵育顯著降低了其對Caco-2/TC-7細胞的侵襲能力，而非凝集酸乳桿菌菌株則沒有此現(xiàn)象，經(jīng)L.kefiriSLP預(yù)處理的凝集菌和非凝集菌均不能侵入Caco-2/TC-7細胞，表明L.kefiri的分泌物及SLP能夠阻擋腸炎沙門氏菌的侵襲。

2.2.2 胞外多糖的免疫調(diào)節(jié)能力

L.kefiri可以通過胞外多糖（extracellular polysaccharide，EPS）來調(diào)節(jié)免疫，EPS在其益生作用中起重要作用，L.kefiri胞外多糖的膠黏性可增強機體的免疫保護作用、免疫刺激活性和抗腫瘤機制。XIU L X等[21]對L.kefiriWXD029的EPS進行體外實驗表明，EPS可顯著增強RAW264.7細胞的增殖和吞噬活性，誘導(dǎo)IL-6等細胞因子的產(chǎn)生。在體內(nèi)，EPS佐劑不僅能提高金黃色葡萄球菌抗體滴度，顯著增強T細胞增殖，還能誘導(dǎo)較強的Th1、Th2和Th17細胞混合反應(yīng)。RAJOKA M S R等[22]對L.kefiriMSR101進行細胞毒性實驗等體外抗腫瘤實驗，發(fā)現(xiàn)其對HT29結(jié)腸癌細胞生長具有抑制能力，并可上調(diào)細胞凋亡蛋白酶的表達，未來可開發(fā)L.kefiriMSR101的EPS作為一種治療結(jié)腸癌并提高免疫力的外用藥物。

因此認為SLP具有菌體黏附和誘導(dǎo)巨噬細胞活化等作用[23]，EPS的膠黏性及抗腫瘤等作用對于微生物免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用[24]，可以進一步運用分子技術(shù)從基因?qū)用嫒嫜芯縇.kefiri的SLP和EPS，揭示SLP和EPS的作用機制。

3 降低膽固醇活性

肥胖在大多數(shù)國家已成為地方病，目前被認為是代謝綜合征的重要危險因素，降低膽固醇是抗肥胖的重要途徑之一，迄今為止，研究人員認為益生菌抗肥胖作用更易為大眾所接受。L.kefiri具有較強降低膽固醇能力。L.kefiri是可以高效、高對映選擇性地合成6-氯代-（3R，5S）-二羥基己酸叔丁酯的微生物菌株，該物質(zhì)是醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)抗膽固醇藥物3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A，HMG-CoA）還原酶抑制劑的重要手性結(jié)構(gòu)單元[25]。KIM D H等[26]以L.kefiriDH5為實驗材料，采用人工胃腸環(huán)境等方法對13株開菲爾實驗室分離菌株進行生存試驗，結(jié)果表明L.kefiriDH5上調(diào)了附屬脂肪組織中過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferators-activated receptors α，PPARα）、脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acid-binding protein 4，F(xiàn)ABP4）和肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1（carnitine palmitoyl transferase 1，CPT1）的表達（分別為2.29-、1.77-和2.05倍），并降低了51.6%的膽固醇，作用十分顯著。趙彤等[27]將L.kefiriKL22接種于膽固醇的改良MRS培養(yǎng)基中，滅活狀態(tài)作用48 h后膽固醇降解率為35.79%。經(jīng)文獻檢索后發(fā)現(xiàn)，膽固醇降解率達到40%以上的菌株寥寥無幾，由此可知L.kefiri的膽固醇降解能力較強[28]。

4 調(diào)節(jié)腸道菌群功能

腸道菌群調(diào)節(jié)功能是乳桿菌最常見的功能活性，通過外源性的補充乳桿菌，可以調(diào)節(jié)和修復(fù)腸道菌群，保持平衡的腸道微環(huán)境[29]。L.kefiri也擁有較強的調(diào)節(jié)腸道菌群組成的能力。KIM D H等[26]通過給雄性C57BL/6小鼠口服L.kefiriDH5一個月后，觀察到受試者腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在細菌總數(shù)無明顯差異的情況下，高脂飲食（high fat diet，HFD）喂養(yǎng)組的擬桿菌門（Bacteroides）、變形菌門（Proteobacteria）和腸桿菌門（Enterobacteriaceae）的數(shù)量顯著增加，HFD-DH5組在HFD喂養(yǎng)組中表現(xiàn)出明顯較低的Bacteroides、Proteobacteria和Enterobacteriaceae，有益菌增加，表明L.kefiriDH5能夠顯著正向調(diào)節(jié)HFD喂養(yǎng)小鼠的腸道微生態(tài)。

5 其他功能活性

L.kefiri還具有抗生素敏感性[30]、黏附性[31]、自凝聚性[32]等功能特性，NEISH A S等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在抗生素敏感性研究中，從乳制品中分離出的一株L.kefiri對卡那霉素和四環(huán)素耐藥，但對其他抗生素敏感，并且能夠抑制病原菌的生長，將在益生菌的臨床使用上起到指導(dǎo)作用。菌體表面疏水性能力的大小反映菌體體內(nèi)定植的能力強弱的大小[34]，L.kefiriKL22對三種有機溶劑中三氯甲烷的吸附能力最強，高達98.5%，表明KL22具有較高的疏水性。趙彤等[27]對KL22的自凝聚能力分析，研究表明菌液自凝集率的上升趨勢并雖不一條直線，但具有明顯趨勢，在1 h內(nèi)自凝聚率17.18%，5 h后自凝聚率達到21.17%，有研究乳桿菌自凝聚能力實驗表明接種4 h后的自凝聚率范圍為7.2%～28.1%[35]，由此表明L.kefiri具有較好的自凝聚能力。

6 結(jié)論與展望

該文主要探討了L.kefiri的抗氧化活性、免疫調(diào)節(jié)活性、降脂活性、調(diào)節(jié)腸道菌群活性和其他功能活性，綜述分析表明其具備諸多良好的功能特性，具有較好的益生功能。L.kefiri分離自傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中，來源可靠、安全性高，在發(fā)酵菌種、益生菌種資源開發(fā)中有可挖掘的潛力，有待于進一步研究，以期應(yīng)用于高活菌數(shù)發(fā)酵乳及功能性食品等的制備。