謝玥 張紹衡 熊瑤 于長(zhǎng)輝

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）是消化內(nèi)科常見疾病類型，以腹瀉、腹痛、黏液膿血便為主要特征，具有反復(fù)發(fā)作、遷延難愈特點(diǎn)，因此準(zhǔn)確地對(duì)UC 做出診斷及評(píng)估病情意義重大［1］。目前結(jié)腸鏡檢查和造影是診斷UC 有效方法，但為侵入性，部分患者接受度較差，且不能用于肛管直腸狹窄、腸穿孔、急性期感染、肛周膿腫及嚴(yán)重心腦血管病變者等，具有一定局限性。胱天蛋白酶募集域蛋白9（Caspase recruitment domain -containingprotein 9，

CARD9）基因多態(tài)性可增加炎癥性腸病易感性，敲除CARD9基因后，腸道炎性反應(yīng)損傷明顯改善［2］。髓樣樹突狀細(xì)胞（Myeloid dendritic cell，MDC）在免疫反應(yīng)和免疫耐受中起到重要作用，可影響腸道黏膜免疫功能及腸道通透性，而UC 患者腸壁內(nèi)存在過度免疫激活及腸黏膜屏障功能的改變，故推測(cè)MDC 與UC 有關(guān)［3-4］。白介素-32（Interleukin-32，IL-32）主要由淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等產(chǎn)生，是一種炎癥細(xì)胞因子，與病毒感染、乙肝等多種炎癥類疾病的發(fā)生有關(guān)［5-6］。本研究探討PBMC 中CARD9、MDC、IL-32 在潰瘍性結(jié)腸炎診斷和病情評(píng)估中價(jià)值，旨在為臨床診療提供參考，報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2021年1月南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院消化內(nèi)科收治的82 例潰瘍性結(jié)腸炎患者（UC 組）及體檢中心40 例健康體檢人群（對(duì)照組）進(jìn)行前瞻性研究，其中UC 組女46 例，男36 例，年齡平均（35.49±4.68）歲，體質(zhì)量指數(shù)平均（22.37±1.21）kg/m2；對(duì)照組女18 例，男22 例，年齡平均（36.22±4.07）歲，體質(zhì)量指數(shù)平均（22.48±1.05）kg/m2。兩組性別、年齡等資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過，患者及家屬均知情同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合UC 診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］；②首次確診，既往無相關(guān)治療史；③年齡＞18 歲；④自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①血液系統(tǒng)疾病者；②自身免疫疾病者；③合并惡性腫瘤者；④妊娠期患者。

1.2 方法

1.2.1 UC 病情程度評(píng)估［7］

參考改良Mayo 評(píng)分評(píng)估病情，緩解期：＜3 分，活動(dòng)期：≥3 分；輕度：3～5 分；中度：6～10 分；重度：11～12 分。

1.2.2 檢測(cè)方法

采集清晨空腹肘部靜脈血5 mL，應(yīng)用Ficoll 密度梯度離心法分離純化外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC），應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)PBMC 中CARD9mRNA、IL-32mRNA，其中CARD9mRNA 上游引物5′-CCGCGTCTTCTCCATGAT-3′，下游引物5′-CCGCAGCTCCTTGATGAA-3′，IL-32mRNA 上游引物5′-CGACTTCAAAGAGGGCTACC-3′，下游引物5′-GAGTGAGCTCTGGGTGCTG-3′，內(nèi)參β-actin 上游引物5′-CGTGGACATCCGCAAAGAC-3′，下游引物5′-CTACGGAGCAATGATCTTGA-3′，收集每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值四所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Cycle threshold，Ct）值后應(yīng)用ΔΔCt 法檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量，ΔCt 實(shí)驗(yàn)組基因=實(shí)驗(yàn)組基因的Ct 值-實(shí)驗(yàn)組的β-actin Ct 值，ΔCt 對(duì)照組基因=對(duì)照基因的Ct 值-對(duì)照組β-actin 的Ct 值，ΔΔCt=ΔCt 實(shí)驗(yàn)組基因-ΔCt 對(duì)照組基因，檢測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt；應(yīng)用流式細(xì)胞儀（深圳邁瑞公司BricyteE6）檢測(cè)MDC 水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（）表示，多組間比較以單因素方差分析，兩兩比較以LSD-t檢驗(yàn)，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)，采用受試者工作特征曲線（ROC）及ROC 下面積（AUC）分析各指標(biāo)診斷UC 價(jià)值，采用Spearman 及多分類Logistic 回歸方程分析各指標(biāo)與UC 活動(dòng)期患者病情程度關(guān)系。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組各檢測(cè)指標(biāo)比較

UC 組CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA 及CARD9 蛋白、IL-32 蛋白高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組各檢測(cè)指標(biāo)比較（±s）Table 1 Comparison of test indicators between 2 groups（±s）

組別UC 組對(duì)照組t 值P 值例數(shù)82 40 CARD9 mRNA 0.85±0.27 0.46±0.15 8.506＜0.001 MDC（%）0.48±0.16 0.28±0.09 7.349＜0.001 IL-32 mRNA 2.16±0.71 1.06±0.33 9.306＜0.001 CARD9蛋白0.46±0.13 0.35±0.11 4.605＜0.001 IL-32蛋白0.24±0.06 0.17±0.05 6.374＜0.001

2.2 各檢測(cè)指標(biāo)診斷UC 的ROC

ROC 曲線顯示，單一中MDC 的AUC 0.901（95%CI：0.833～0.947）最大；各指標(biāo)聯(lián)合的AUC 0.920（95%CI：0.857～0.962）大于任一單一指標(biāo)。見表2、圖1。

表2 ROC 分析結(jié)果Table 2 ROC analysis results

圖1 各檢測(cè)指標(biāo)診斷UC 的ROCFigure 1 ROC of each test index to diagnose UC

2.3 UC 患者不同病情程度者各檢測(cè)指標(biāo)比較

活動(dòng)期患者CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA、CARD9蛋白、IL-32 蛋白高于緩解期（P＜0.05），隨著活動(dòng)期患者病情程度加重，CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA、CARD9 蛋白、IL-32 蛋白依次增高，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 UC 患者不同病情程度者各檢測(cè)指標(biāo)比較（±s）Table 3 Comparison of various detection indexes of UC patients with different disease severity（±s）

表3 UC 患者不同病情程度者各檢測(cè)指標(biāo)比較（±s）Table 3 Comparison of various detection indexes of UC patients with different disease severity（±s）

注：與緩解期比較，aP＜0.05；與輕度比較，bP＜0.05；與中度比較，cP＜0.05。

組別活動(dòng)期輕度中度重度緩解期F 值P 值例數(shù)56 19 21 16 26 CARD9 mRNA 0.97±0.25a 0.70±0.18 0.98±0.24b 1.28±0.27bc 0.59±0.16 28.779＜0.001 MDC（%）0.59±0.12a 0.34±0.11 0.60±0.13b 0.87±0.15bc 0.24±0.10 86.265＜0.001 IL-32 mRNA 2.67±0.54a 1.49±0.44 2.06±0.51b 4.87±0.60bc 1.06±0.32 169.266＜0.001 CARD9蛋白0.52±0.11 0.31±0.12 0.57±0.14 0.70±0.13 0.33±0.10 39.571＜0.001 IL-32蛋白0.29±0.08 0.14±0.04 0.28±0.06 0.48±0.09 0.13±0.04 83.6900＜0.001

2.4 各檢測(cè)指標(biāo)與病情程度相關(guān)性

以UC 活動(dòng)期患者各指標(biāo)為源數(shù)據(jù)，采用Spearman 進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，CARD9mRNA（r=0.808，P＜0.001）、MDC（r=0.815，P＜0.001）、IL-32mRNA（r=0.874，P＜0.001）、CARD9 蛋白（r=0.735，P＜0.001）、IL-32 蛋白（r=0.803，P＜0.001）均與病情程度呈正相關(guān)。

2.5 多分類Logistic 回歸方程分析

以病情程度為因變量（1=輕度，2=中度，3=重度），納入CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA 指標(biāo)作為自變量（各指標(biāo)賦值：1=低于UC 組均值，2=高于UC 組均值），應(yīng)用多分類Logistic 回歸方程分析，結(jié)果顯示，CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA是UC 患者病情程度的相關(guān)獨(dú)立影響因素（P＜0.05）。見表4。

表4 Logistic 回歸方程分析Table 4 Multi-class Logistic Regression Equation

3 討論

CARD9mRNA 在人體脾、肝、外周淋巴細(xì)胞等免疫組織中廣泛表達(dá)，包含行使蛋白募集功能的胱天蛋白募集域和行使蛋白質(zhì)寡聚化功能的卷曲螺旋域，能通過與B 細(xì)胞淋巴瘤因子-10、絲裂原活化蛋白激酶等作用，有效整合多種固有免疫受體識(shí)別信號(hào)，正常情況下，在小腸和結(jié)腸中處于低表達(dá)狀態(tài)［8］。杜曉博等［9］報(bào)道，CARD9 蛋白在炎癥性腸病患者腸組織中表達(dá)高于正常腸組織，與患者病情程度呈正相關(guān)，本研究觀點(diǎn)與之相似，但本研究檢測(cè)的是PBMC 中CARD9mRNA 和CARD9 蛋白表達(dá)，無需有創(chuàng)性獲取腸組織標(biāo)本，更具臨床實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。UC 是慢性、反復(fù)發(fā)作性腸道炎癥反應(yīng)，而CARD9mRNA 是腸道固有免疫反應(yīng)中重要銜接物質(zhì)，能通過與肽聚糖反應(yīng)增加腫瘤壞死因子、白介素-6 等炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，對(duì)腸黏膜造成炎性損傷，破壞腸黏膜屏障作用，影響腸道免疫系統(tǒng)對(duì)微生物抗原耐受情況，從而引起錯(cuò)誤的免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)，參與UC 發(fā)生與進(jìn)展［10］。同時(shí)UC 患者糞便和黏膜中總真菌負(fù)荷增加，CARD9mRNA和CARD9蛋白升高有利于馬拉色菌定植，從而加劇腸道炎癥［11］。

骨髓細(xì)胞，尤其單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，在先天免疫以及適應(yīng)性免疫的啟動(dòng)和維持中起著至關(guān)重要作用［12］。重度UC 患者治療前PBMC 中MDC 處于高水平狀態(tài)，治療后有效患者則明顯降低，若持續(xù)升高，提示預(yù)后不良，佐證了MDC 在UC 病情和預(yù)后評(píng)估中的作用［13］。MDC 是髓樣樹突狀細(xì)胞，具有抗原提呈作用，可經(jīng)淋巴管將抗原提呈給未致敏的T 淋巴細(xì)胞，使T 淋巴細(xì)胞異常激活及腸道黏膜中髓系細(xì)胞浸潤，介導(dǎo)腸黏膜的免疫炎癥損傷，破壞腸黏膜的固有免疫反應(yīng)，因此與UC 發(fā)生和病情進(jìn)展有關(guān)。當(dāng)PBMC 中MDC＞0.39%時(shí)，診斷UC 的AUC 為0.901，敏感度為87.80%，特異度為82.50%，能為臨床無創(chuàng)性、簡(jiǎn)便性診斷UC 提供參考。

IL-32mRNA 參與自然殺傷細(xì)胞正常功能、單核細(xì)胞分化、角質(zhì)細(xì)胞凋亡、樹突細(xì)胞成熟的調(diào)節(jié)［14］。本研究顯示，UC 患者IL-32mRNA 高于健康人群，與羅莉蕓等［15］報(bào)道一致，提示IL-32mRNA 與UC 發(fā)病有關(guān)。IL-32mRNA 能通過激活核轉(zhuǎn)錄因子-kB 和P38 絲裂原活化蛋白激酶途徑誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生白介素-8、腫瘤壞死因子，并能誘導(dǎo)PBMC產(chǎn)生白介素-6、白介素-1β，而生白介素-8、腫瘤壞死因子、白介素-6、白介素-1β 均是UC 中重要的炎性細(xì)胞因子，能使炎癥區(qū)域聚集大量的異常致敏的T 細(xì)胞，導(dǎo)致腸黏膜潰瘍，加重腸黏膜炎癥損傷，所以與UC 發(fā)病及病情進(jìn)展有關(guān)。另聯(lián)合應(yīng)用的ROC 分析顯示，聯(lián)合檢測(cè)CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA 診斷UC 的AUC高于單一指標(biāo)，故建議條件允許時(shí)，聯(lián)合檢測(cè)三者，從而為臨床診斷提供更可靠的參考。

綜 上，UC 患 者PBMC 中CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA、CARD9 蛋白、IL-32 蛋白顯著升高，并與病情程度有關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA 能為臨床診斷UC 及評(píng)估UC 病情提供參考。