徐 明，汪 瓊，李冬玲，鄭玉紅，徐增萊

（江蘇省中國科學(xué)院植物研究所，南京 210014）

0 引言

蓼藍(lán)(Polygonum tinctoriumAit.)是蓼科(Polygonaceae)、蓼屬(PolygonumL.)一年生草本植物。葉可藥用，清熱解毒；又可加工制成靛藍(lán)，作染料，具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值。蓼藍(lán)是中國最早被記錄的藍(lán)染植物，據(jù)考證，《詩經(jīng)》中反復(fù)詠嘆的“藍(lán)”便是蓼藍(lán)，隨著菘藍(lán)和板藍(lán)的栽培推廣，蓼藍(lán)的種植面積逐漸萎縮[1]。近年來，人們生態(tài)環(huán)保意識逐漸增強(qiáng)，植物染料越來越受關(guān)注，與化學(xué)染料相較，植物染料染色由于取材于自然，使用過后色素能分解而回歸于自然，這種自然資源永續(xù)利用的做法，正符合綠色工藝的環(huán)保概念，符合可持續(xù)發(fā)展的時(shí)代要求。因此，繼續(xù)使用歷史上沿襲下來的可再生性和無污染的天然植物染料，既經(jīng)濟(jì)又環(huán)保，不失為保持生態(tài)文化的一種必然選擇[2]。蓼藍(lán)作為植物靛藍(lán)染料的來源植物之一，理應(yīng)受到重視和保護(hù)。

蓼藍(lán)是蓼大青葉的來源植物，研究表明蓼大青葉的化學(xué)成分主要有靛藍(lán)、靛玉紅、N-苯基-2-萘胺等[3]；有學(xué)者對蓼藍(lán)根、莖和葉中所含的化合物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其含有吲哚苷、β-谷甾醇和4(3H)喹唑酮等多種化合物[4-5]；此外，蓼藍(lán)的地上部分含有豐富的黃酮醇O-糖苷，并且以3,5,4'-三羥基-6,7-亞甲基二氧基黃酮(TMF)為糖苷配基的黃酮O-糖苷表現(xiàn)出更高的抗氧化活性，遂具有發(fā)展為天然藥物的潛力[6-7]；Kukula等[8]使用離心分配色譜法對蓼藍(lán)葉中的靛藍(lán)和靛玉紅進(jìn)行定量分析和回收并建立相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。蓼藍(lán)的分子生物學(xué)研究多集中在靛藍(lán)合成途徑相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄組方面的分析[9]，Wang等[10]對不同收獲時(shí)期的蓼藍(lán)的代謝產(chǎn)物及轉(zhuǎn)錄組分析表明靛藍(lán)和靛玉紅含量在不同收獲時(shí)期不同且靛藍(lán)含量高的時(shí)期負(fù)責(zé)靛藍(lán)靛玉紅表達(dá)的基因表達(dá)水平顯著提高；Jin等[11]從蓼藍(lán)中克隆了2個(gè)吲哚-3-甘油磷酸裂解酶同源物的cDNA，并證實(shí)這兩者都與蓼藍(lán)植株內(nèi)的靛藍(lán)合成息息相關(guān)；許輝輝等[12]通過蓼藍(lán)轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)基因TRINITY_DN59463_c0_g1和基因TRINITY_DN89385_c3_g1不僅參與了細(xì)胞色素P450單氧酶的合成，而且其基因表達(dá)量變化趨勢與靛藍(lán)和靛玉紅的含量變化趨勢一致。Inoue等[13]對蓼藍(lán)的吲哚苷合酶組織特異性及細(xì)胞內(nèi)定位進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)蓼藍(lán)吲哚-β-D-葡萄糖苷合酶是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的吲哚苷合成酶，且僅存在于葉片之中。綜上所述，目前對蓼藍(lán)的研究主要集中于化學(xué)成分，藥理作用和靛藍(lán)、靛玉紅相關(guān)基因的克隆和表達(dá)分析方面，但對蓼藍(lán)不同居群之間的遺傳多樣性鮮有研究報(bào)道，且更無使用ISSR標(biāo)記技術(shù)來對蓼藍(lán)進(jìn)行遺傳多樣性分析的研究。

ISSR(inter-simple sequence repeat)分子標(biāo)記是一種以微衛(wèi)星序列為引物，進(jìn)行多位點(diǎn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增的技術(shù)，ISSR技術(shù)同時(shí)具備擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)、簡單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR)、和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)等分子標(biāo)記方法的優(yōu)點(diǎn)[14]，更具有模板DNA用量少、操作簡單、快速、可靠、多態(tài)性豐富等優(yōu)勢[15]，被廣泛應(yīng)用于金錢草、菘藍(lán)和頭花蓼等多種植物的遺傳多樣性分析，是一種廣泛使用的研究植物遺傳多樣性和親緣關(guān)系的方法[16-18]。本研究采用ISSR技術(shù)對江蘇、山東、四川、貴州和日本的5個(gè)蓼藍(lán)居群進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在闡明不同居群蓼藍(lán)的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性水平且為蓼藍(lán)的遺傳分析和育種栽培提供分子生物學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選擇原生于四川省(SC)、山東省(SD)、江蘇省(JS)、貴州省(GZ)和日本(RB)的5個(gè)蓼藍(lán)居群，隨機(jī)采集成年個(gè)體的健康新鮮葉片，每居群5個(gè)個(gè)體。采樣后迅速轉(zhuǎn)移至冰箱-20℃保存，樣品信息見表1。實(shí)驗(yàn)在江蘇省中國科學(xué)院植物研究所藥用植物研究中心，于2019年7月—2019年12月份進(jìn)行。

表1 供試蓼藍(lán)材料采集地

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用天根植物基因組提取試劑盒提取蓼藍(lán)材料DNA，使用ONE Drop OD-2000+超微量分光光度計(jì)測定提取的DNA濃度，最后稀釋至20 ng/μL放入-20℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蓼藍(lán)ISSR引物篩選和擴(kuò)增 本研究所用引物由英杰生命技術(shù)有限公司合成，引物設(shè)計(jì)以加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的序列為參照。使用SC進(jìn)行引物篩選，反應(yīng)體系參照周濤[18]方法并加以改進(jìn)，最終確定：ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為20 μL，包括模板DNA 40 ng，2×MasterMix 10 μL，引物0.6 μmol/L，加雙蒸水至20 μL；擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，48℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，循環(huán)40次；72℃后延伸7 min。

1.2.3 ISSR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測 PCR反應(yīng)在杭州博日科技有限公司的G 1000基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序同1.2.2。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0×TAE配制的1%瓊脂糖凝膠電泳分離，以DiGelRed染色，標(biāo)準(zhǔn)分子對照為DL2000（天根生化科技有限公司），使用君意JY04S-3E凝膠成像系統(tǒng)檢測拍照保存。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 使用Gel-Pro Application對電泳圖片進(jìn)行標(biāo)記分析，根據(jù)條帶遷移率生成0,1二態(tài)性數(shù)據(jù)矩陣。使用Popgene 32統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算居群的觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei′s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon′s多態(tài)性信息指數(shù)(I)、總基因多樣性(Ht)、群體內(nèi)基因多樣性(Hs)、基因分化系數(shù)(Gst)和居群總基因流(Nm)[19-20]，進(jìn)行遺傳多樣性分析。根據(jù)Popgene 32得出遺傳距離矩陣，依據(jù)UPGMA法使用NTsys2.10e軟件構(gòu)建居群間遺傳關(guān)系聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同引物擴(kuò)增產(chǎn)物及其多態(tài)性

100條引物篩選出23條多態(tài)性好、條帶分布清晰易辯的引物進(jìn)行擴(kuò)增。這23條引物對5個(gè)居群蓼藍(lán)擴(kuò)增的多態(tài)性結(jié)果見表2，不同引物對不同居群的ISSR擴(kuò)增電泳圖見圖1。由表2看出，篩選出的引物對蓼藍(lán)5個(gè)居群的共25個(gè)個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)增，得到在片段長度在100～2000 bp的共155位點(diǎn)；不同引物擴(kuò)增的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)從4～8不等；平均每個(gè)引物檢測到6.43個(gè)位點(diǎn)；總多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為148；總多態(tài)位點(diǎn)百分率為95.48%。

圖1 引物874、859、857、847（從左到右）的ISSR擴(kuò)增電泳圖

表2 ISSR引物及擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性水平

續(xù)表2

2.2 蓼藍(lán)遺傳多樣性統(tǒng)計(jì)參數(shù)

Popgene 32分析結(jié)果表明（表3），5個(gè)居群的多態(tài)性位點(diǎn)百分率在46.45%～61.29%之間，其中最高的是貴州居群61.29%，最低的是四川居群46.45%。Na在1.4645～1.6129之間，居群水平的平均值為1.5264，其中四川、江蘇居群低于平均值，山東、貴州、日本高于平均值；物種水平的平均值為1.9548。Ne在1.3147～1.4780之間，居群水平平均值為1.3736，其中貴州，日本居群高于平均值，四川、山東和江蘇居群低于平均值。H分布在0.1787～0.2591平均值為0.2088；I分布在0.2629～0.3729，平均值為0.3050，貴州和日本居群的遺傳多樣性參數(shù)高于平均水平，四川、山東和江蘇居群的遺傳多樣性參數(shù)低于平均水平?？傮w來看，日本和貴州居群的遺傳多樣性水平比四川、山東和江蘇居群的高。

表3 蓼藍(lán)居群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)參數(shù)

2.3 蓼藍(lán)居群的遺傳分化

Popgene 32分析結(jié)果顯示（表4），Ht為0.3538，Hs為0.2088。Gst為0.4096，表明有40.96%的遺傳變異存在于居群間，有59.04%的遺傳變異存在于居群內(nèi)；Nm為0.7206說明5個(gè)居群間存在一定程度的基因流動(dòng)，且蓼藍(lán)居群內(nèi)的遺傳分化大于居群間的遺傳分化。

表4 ISSR標(biāo)記對蓼藍(lán)居群基因多樣性Nei’s分析

2.4 聚類分析

根據(jù)ISSR標(biāo)記由Popgene 32計(jì)算得出遺傳距離矩陣依照UPGMA法構(gòu)建居群間遺傳關(guān)系聚類圖（圖2），結(jié)果表明ISSR標(biāo)記能夠?qū)?個(gè)蓼藍(lán)居群完全區(qū)分開。從聚類圖來看山東、江蘇和貴州居群的親緣關(guān)系比較接近，日本居群和其他居群相比變異比較明顯；以遺傳距離0.234為閾值可將5個(gè)居群分為三類，表明不同居群在分子水平上存在一定分化。

圖2 基于Nei’s遺傳距離的5個(gè)蓼藍(lán)居群的UPGMA聚類圖

3 討論與結(jié)論

本研究首次使用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對5個(gè)不同居群蓼藍(lán)的遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行分析，篩選得到的23條ISSR引物PCR擴(kuò)增出155個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)148個(gè)，總多態(tài)位點(diǎn)百分率為95.48%，表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性。Popgene 32分析得到的Na在居群水平為1.5264，物種水平為1.9548；Ne在居群水平為1.3736，物種水平為1.6161；H在居群水平為0.2088，物種水平為0.3538；I在居群水平為0.3050，物種水平為0.5234。說明這5個(gè)居群蓼藍(lán)在物種水平具有較高的遺傳多樣性，這與Wang等[21]使用ISSR分子標(biāo)記對蓼科植物掌葉大黃(Rheum palmatum)和唐古特大黃(Rheum tanguticum)的研究結(jié)果相符；從居群水平來看，5個(gè)居群蓼藍(lán)具有一定的遺傳多樣性，且居群內(nèi)遺傳分化相對比居群間高，這一結(jié)果與Hu等[22]對野生和栽培唐古特大黃(R.tanguticum)進(jìn)行了遺傳多樣性分析的研究結(jié)果基本一致。本研究表明ISSR分子標(biāo)記是一種能夠很好的解釋蓼藍(lán)間的遺傳變異的分子標(biāo)記方法。

遺傳多樣性是任何居群的最重要屬性之一。環(huán)境在不斷變化，如果居群要不斷進(jìn)化并適應(yīng)新情況，就必須有遺傳多樣性。地理距離近的居群生境相似，地理距離遠(yuǎn)的居群生境差異相對較大。在環(huán)境選擇壓力的作用下，不同居群之間的分子變異可能與地理位置聯(lián)系比較大[19]。5個(gè)居群蓼藍(lán)分布在25°N—37°N；103°E—133°E的地理范圍內(nèi)，該范圍包含不同氣候區(qū)域和地理環(huán)境，造成各居群蓼藍(lán)生境差異較大；蓼藍(lán)的5個(gè)居群中，山東江蘇居群間的地理距離相對較近，因而遺傳距離較近；日本居群與其他居群的地理距離相對較遠(yuǎn)，具有較為獨(dú)特的地理環(huán)境（島國）和氣候條件（溫帶海洋季風(fēng)氣候）因此日本居群與其他4居群遺傳距離較遠(yuǎn)。居群間的差異可能為人類種植馴化以及遷徙至不同氣候區(qū)其適應(yīng)環(huán)境造成的結(jié)果。Nm的數(shù)值是影響居群遺傳結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素[23]，當(dāng)Nm>1時(shí)，基因流動(dòng)是增加群體之間遺傳相似性和抵抗種群內(nèi)部遺傳漂移的重要因素。如果1>Nm>0.5，則基因流動(dòng)較弱；而當(dāng)0.5>Nm>0時(shí)，基因完全分離[24]；在本研究中，Nm的值為0.7206，表明居群之間在一定程度上存在著基因流動(dòng)，基因流數(shù)據(jù)同時(shí)也從解釋了各居群間總遺傳距離差距不大的原因。

本實(shí)驗(yàn)限于植物材料的稀缺性，每一居群僅收集了5個(gè)個(gè)體進(jìn)行ISSR分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定的參考價(jià)值，但實(shí)驗(yàn)材料較少有可能導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)結(jié)果有所偏差；另外ISSR分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)體系參照周濤[18]貴州頭花蓼ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化而來，并未專門進(jìn)行蓼藍(lán)ISSR-PCR分子標(biāo)記反應(yīng)體系的建立，ISSR-PCR反應(yīng)體系還有進(jìn)一步優(yōu)化的空間。目前，對不同居群蓼藍(lán)進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系的研究少之又少，因此對不同居群蓼藍(lán)的遺傳多樣性研究前景廣闊。植物靛藍(lán)一直是世界上應(yīng)用最廣泛和最重要的染料[25]，中國最早的詩歌總集《詩經(jīng)》中就有“青青子衿，悠悠我心”的記載，足見中國悠久的藍(lán)染歷史。清末民國，國外合成染料進(jìn)入中國市場，藍(lán)染植物的種植使用便越來越少，直至被淘汰[26]。蓼藍(lán)的種植也隨著傳統(tǒng)藍(lán)染紡織行業(yè)的衰微而急劇縮減，僅有少數(shù)地區(qū)有其種質(zhì)資源留存[27]，因此蓼藍(lán)種質(zhì)資源的收集和發(fā)掘工作任重道遠(yuǎn)。此外，蓼藍(lán)作為一種藥用植物，可用于制作蓼大青葉和青黛等中藥，因此對蓼藍(lán)進(jìn)行遺傳多樣性研究對其種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有重要意義。

本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對來自5個(gè)居群的25個(gè)個(gè)體進(jìn)行遺傳多樣性分析，并通過UPGMA法根據(jù)遺傳距離進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明不同居群蓼藍(lán)具有一定的遺傳多樣性且不同居群蓼藍(lán)的遺傳距離和地理位置分布相關(guān)；同時(shí)也說明ISSR分子標(biāo)記技術(shù)是一種行之有效的揭示不同居群間蓼藍(lán)遺傳差異和親緣關(guān)系的方法，對蓼藍(lán)種質(zhì)資源的利用，開發(fā)和保護(hù)提供了參考依據(jù)。

致謝：感謝南通水色染坊王浩然先生贈(zèng)送日本蓼藍(lán)樣品。