徐 明，汪 瓊，李冬玲，鄭玉紅，徐增萊

（江蘇省中國科學院植物研究所，南京 210014）

0 引言

蓼藍(Polygonum tinctoriumAit.)是蓼科(Polygonaceae)、蓼屬(PolygonumL.)一年生草本植物。葉可藥用，清熱解毒；又可加工制成靛藍，作染料，具有一定的經(jīng)濟價值和藥用價值。蓼藍是中國最早被記錄的藍染植物，據(jù)考證，《詩經(jīng)》中反復詠嘆的“藍”便是蓼藍，隨著菘藍和板藍的栽培推廣，蓼藍的種植面積逐漸萎縮[1]。近年來，人們生態(tài)環(huán)保意識逐漸增強，植物染料越來越受關注，與化學染料相較，植物染料染色由于取材于自然，使用過后色素能分解而回歸于自然，這種自然資源永續(xù)利用的做法，正符合綠色工藝的環(huán)保概念，符合可持續(xù)發(fā)展的時代要求。因此，繼續(xù)使用歷史上沿襲下來的可再生性和無污染的天然植物染料，既經(jīng)濟又環(huán)保，不失為保持生態(tài)文化的一種必然選擇[2]。蓼藍作為植物靛藍染料的來源植物之一，理應受到重視和保護。

蓼藍是蓼大青葉的來源植物，研究表明蓼大青葉的化學成分主要有靛藍、靛玉紅、N-苯基-2-萘胺等[3]；有學者對蓼藍根、莖和葉中所含的化合物進行研究，發(fā)現(xiàn)其含有吲哚苷、β-谷甾醇和4(3H)喹唑酮等多種化合物[4-5]；此外，蓼藍的地上部分含有豐富的黃酮醇O-糖苷，并且以3,5,4'-三羥基-6,7-亞甲基二氧基黃酮(TMF)為糖苷配基的黃酮O-糖苷表現(xiàn)出更高的抗氧化活性，遂具有發(fā)展為天然藥物的潛力[6-7]；Kukula等[8]使用離心分配色譜法對蓼藍葉中的靛藍和靛玉紅進行定量分析和回收并建立相應的質量標準。蓼藍的分子生物學研究多集中在靛藍合成途徑相關基因和轉錄組方面的分析[9]，Wang等[10]對不同收獲時期的蓼藍的代謝產(chǎn)物及轉錄組分析表明靛藍和靛玉紅含量在不同收獲時期不同且靛藍含量高的時期負責靛藍靛玉紅表達的基因表達水平顯著提高；Jin等[11]從蓼藍中克隆了2個吲哚-3-甘油磷酸裂解酶同源物的cDNA，并證實這兩者都與蓼藍植株內(nèi)的靛藍合成息息相關；許輝輝等[12]通過蓼藍轉錄組測序發(fā)現(xiàn)基因TRINITY_DN59463_c0_g1和基因TRINITY_DN89385_c3_g1不僅參與了細胞色素P450單氧酶的合成，而且其基因表達量變化趨勢與靛藍和靛玉紅的含量變化趨勢一致。Inoue等[13]對蓼藍的吲哚苷合酶組織特異性及細胞內(nèi)定位進行研究發(fā)現(xiàn)蓼藍吲哚-β-D-葡萄糖苷合酶是定位于內(nèi)質網(wǎng)膜的吲哚苷合成酶，且僅存在于葉片之中。綜上所述，目前對蓼藍的研究主要集中于化學成分，藥理作用和靛藍、靛玉紅相關基因的克隆和表達分析方面，但對蓼藍不同居群之間的遺傳多樣性鮮有研究報道，且更無使用ISSR標記技術來對蓼藍進行遺傳多樣性分析的研究。

ISSR(inter-simple sequence repeat)分子標記是一種以微衛(wèi)星序列為引物，進行多位點聚合酶鏈式反應(PCR)擴增的技術，ISSR技術同時具備擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)、簡單重復序列標記(SSR)、和隨機擴增多態(tài)性DNA標記(RAPD)等分子標記方法的優(yōu)點[14]，更具有模板DNA用量少、操作簡單、快速、可靠、多態(tài)性豐富等優(yōu)勢[15]，被廣泛應用于金錢草、菘藍和頭花蓼等多種植物的遺傳多樣性分析，是一種廣泛使用的研究植物遺傳多樣性和親緣關系的方法[16-18]。本研究采用ISSR技術對江蘇、山東、四川、貴州和日本的5個蓼藍居群進行遺傳多樣性分析，旨在闡明不同居群蓼藍的遺傳結構和遺傳多樣性水平且為蓼藍的遺傳分析和育種栽培提供分子生物學依據(jù)和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選擇原生于四川省(SC)、山東省(SD)、江蘇省(JS)、貴州省(GZ)和日本(RB)的5個蓼藍居群，隨機采集成年個體的健康新鮮葉片，每居群5個個體。采樣后迅速轉移至冰箱-20℃保存，樣品信息見表1。實驗在江蘇省中國科學院植物研究所藥用植物研究中心，于2019年7月—2019年12月份進行。

表1 供試蓼藍材料采集地

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用天根植物基因組提取試劑盒提取蓼藍材料DNA，使用ONE Drop OD-2000+超微量分光光度計測定提取的DNA濃度，最后稀釋至20 ng/μL放入-20℃冰箱里儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蓼藍ISSR引物篩選和擴增 本研究所用引物由英杰生命技術有限公司合成，引物設計以加拿大哥倫比亞大學公布的序列為參照。使用SC進行引物篩選，反應體系參照周濤[18]方法并加以改進，最終確定：ISSR-PCR擴增反應總體積為20 μL，包括模板DNA 40 ng，2×MasterMix 10 μL，引物0.6 μmol/L，加雙蒸水至20 μL；擴增程序為94℃預變性5 min；94℃變性30 s，48℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，循環(huán)40次；72℃后延伸7 min。

1.2.3 ISSR擴增及產(chǎn)物檢測 PCR反應在杭州博日科技有限公司的G 1000基因擴增儀上進行，擴增程序同1.2.2。PCR擴增產(chǎn)物用1.0×TAE配制的1%瓊脂糖凝膠電泳分離，以DiGelRed染色，標準分子對照為DL2000（天根生化科技有限公司），使用君意JY04S-3E凝膠成像系統(tǒng)檢測拍照保存。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 使用Gel-Pro Application對電泳圖片進行標記分析，根據(jù)條帶遷移率生成0,1二態(tài)性數(shù)據(jù)矩陣。使用Popgene 32統(tǒng)計軟件計算居群的觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei′s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon′s多態(tài)性信息指數(shù)(I)、總基因多樣性(Ht)、群體內(nèi)基因多樣性(Hs)、基因分化系數(shù)(Gst)和居群總基因流(Nm)[19-20]，進行遺傳多樣性分析。根據(jù)Popgene 32得出遺傳距離矩陣，依據(jù)UPGMA法使用NTsys2.10e軟件構建居群間遺傳關系聚類圖。

2 結果與分析

2.1 不同引物擴增產(chǎn)物及其多態(tài)性

100條引物篩選出23條多態(tài)性好、條帶分布清晰易辯的引物進行擴增。這23條引物對5個居群蓼藍擴增的多態(tài)性結果見表2，不同引物對不同居群的ISSR擴增電泳圖見圖1。由表2看出，篩選出的引物對蓼藍5個居群的共25個個體進行擴增，得到在片段長度在100～2000 bp的共155位點；不同引物擴增的多態(tài)位點數(shù)從4～8不等；平均每個引物檢測到6.43個位點；總多態(tài)性位點數(shù)為148；總多態(tài)位點百分率為95.48%。

圖1 引物874、859、857、847（從左到右）的ISSR擴增電泳圖

表2 ISSR引物及擴增產(chǎn)物多態(tài)性水平

續(xù)表2

2.2 蓼藍遺傳多樣性統(tǒng)計參數(shù)

Popgene 32分析結果表明（表3），5個居群的多態(tài)性位點百分率在46.45%～61.29%之間，其中最高的是貴州居群61.29%，最低的是四川居群46.45%。Na在1.4645～1.6129之間，居群水平的平均值為1.5264，其中四川、江蘇居群低于平均值，山東、貴州、日本高于平均值；物種水平的平均值為1.9548。Ne在1.3147～1.4780之間，居群水平平均值為1.3736，其中貴州，日本居群高于平均值，四川、山東和江蘇居群低于平均值。H分布在0.1787～0.2591平均值為0.2088；I分布在0.2629～0.3729，平均值為0.3050，貴州和日本居群的遺傳多樣性參數(shù)高于平均水平，四川、山東和江蘇居群的遺傳多樣性參數(shù)低于平均水平。總體來看，日本和貴州居群的遺傳多樣性水平比四川、山東和江蘇居群的高。

表3 蓼藍居群遺傳多樣性和遺傳結構的統(tǒng)計參數(shù)

2.3 蓼藍居群的遺傳分化

Popgene 32分析結果顯示（表4），Ht為0.3538，Hs為0.2088。Gst為0.4096，表明有40.96%的遺傳變異存在于居群間，有59.04%的遺傳變異存在于居群內(nèi)；Nm為0.7206說明5個居群間存在一定程度的基因流動，且蓼藍居群內(nèi)的遺傳分化大于居群間的遺傳分化。

表4 ISSR標記對蓼藍居群基因多樣性Nei’s分析

2.4 聚類分析

根據(jù)ISSR標記由Popgene 32計算得出遺傳距離矩陣依照UPGMA法構建居群間遺傳關系聚類圖（圖2），結果表明ISSR標記能夠將5個蓼藍居群完全區(qū)分開。從聚類圖來看山東、江蘇和貴州居群的親緣關系比較接近，日本居群和其他居群相比變異比較明顯；以遺傳距離0.234為閾值可將5個居群分為三類，表明不同居群在分子水平上存在一定分化。

圖2 基于Nei’s遺傳距離的5個蓼藍居群的UPGMA聚類圖

3 討論與結論

本研究首次使用ISSR分子標記技術對5個不同居群蓼藍的遺傳多樣性及親緣關系進行分析，篩選得到的23條ISSR引物PCR擴增出155個位點，其中多態(tài)性位點148個，總多態(tài)位點百分率為95.48%，表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性。Popgene 32分析得到的Na在居群水平為1.5264，物種水平為1.9548；Ne在居群水平為1.3736，物種水平為1.6161；H在居群水平為0.2088，物種水平為0.3538；I在居群水平為0.3050，物種水平為0.5234。說明這5個居群蓼藍在物種水平具有較高的遺傳多樣性，這與Wang等[21]使用ISSR分子標記對蓼科植物掌葉大黃(Rheum palmatum)和唐古特大黃(Rheum tanguticum)的研究結果相符；從居群水平來看，5個居群蓼藍具有一定的遺傳多樣性，且居群內(nèi)遺傳分化相對比居群間高，這一結果與Hu等[22]對野生和栽培唐古特大黃(R.tanguticum)進行了遺傳多樣性分析的研究結果基本一致。本研究表明ISSR分子標記是一種能夠很好的解釋蓼藍間的遺傳變異的分子標記方法。

遺傳多樣性是任何居群的最重要屬性之一。環(huán)境在不斷變化，如果居群要不斷進化并適應新情況，就必須有遺傳多樣性。地理距離近的居群生境相似，地理距離遠的居群生境差異相對較大。在環(huán)境選擇壓力的作用下，不同居群之間的分子變異可能與地理位置聯(lián)系比較大[19]。5個居群蓼藍分布在25°N—37°N；103°E—133°E的地理范圍內(nèi)，該范圍包含不同氣候區(qū)域和地理環(huán)境，造成各居群蓼藍生境差異較大；蓼藍的5個居群中，山東江蘇居群間的地理距離相對較近，因而遺傳距離較近；日本居群與其他居群的地理距離相對較遠，具有較為獨特的地理環(huán)境（島國）和氣候條件（溫帶海洋季風氣候）因此日本居群與其他4居群遺傳距離較遠。居群間的差異可能為人類種植馴化以及遷徙至不同氣候區(qū)其適應環(huán)境造成的結果。Nm的數(shù)值是影響居群遺傳結構的關鍵因素[23]，當Nm>1時，基因流動是增加群體之間遺傳相似性和抵抗種群內(nèi)部遺傳漂移的重要因素。如果1>Nm>0.5，則基因流動較弱；而當0.5>Nm>0時，基因完全分離[24]；在本研究中，Nm的值為0.7206，表明居群之間在一定程度上存在著基因流動，基因流數(shù)據(jù)同時也從解釋了各居群間總遺傳距離差距不大的原因。

本實驗限于植物材料的稀缺性，每一居群僅收集了5個個體進行ISSR分子標記實驗，實驗結果具有一定的參考價值，但實驗材料較少有可能導致統(tǒng)計結果有所偏差；另外ISSR分子標記實驗的反應體系參照周濤[18]貴州頭花蓼ISSR-PCR反應體系優(yōu)化而來，并未專門進行蓼藍ISSR-PCR分子標記反應體系的建立，ISSR-PCR反應體系還有進一步優(yōu)化的空間。目前，對不同居群蓼藍進行遺傳多樣性和親緣關系的研究少之又少，因此對不同居群蓼藍的遺傳多樣性研究前景廣闊。植物靛藍一直是世界上應用最廣泛和最重要的染料[25]，中國最早的詩歌總集《詩經(jīng)》中就有“青青子衿，悠悠我心”的記載，足見中國悠久的藍染歷史。清末民國，國外合成染料進入中國市場，藍染植物的種植使用便越來越少，直至被淘汰[26]。蓼藍的種植也隨著傳統(tǒng)藍染紡織行業(yè)的衰微而急劇縮減，僅有少數(shù)地區(qū)有其種質資源留存[27]，因此蓼藍種質資源的收集和發(fā)掘工作任重道遠。此外，蓼藍作為一種藥用植物，可用于制作蓼大青葉和青黛等中藥，因此對蓼藍進行遺傳多樣性研究對其種質資源的開發(fā)和利用具有重要意義。

本研究利用ISSR分子標記技術對來自5個居群的25個個體進行遺傳多樣性分析，并通過UPGMA法根據(jù)遺傳距離進行聚類分析。結果表明不同居群蓼藍具有一定的遺傳多樣性且不同居群蓼藍的遺傳距離和地理位置分布相關；同時也說明ISSR分子標記技術是一種行之有效的揭示不同居群間蓼藍遺傳差異和親緣關系的方法，對蓼藍種質資源的利用，開發(fā)和保護提供了參考依據(jù)。

致謝：感謝南通水色染坊王浩然先生贈送日本蓼藍樣品。