徐世民，劉 洋，潘洪發(fā)，史玉林，王瑞泓，高加智

（山東省濰坊市人民醫(yī)院脊柱外科，山東濰坊 261041）

椎間盤退行性病變（intervertebral disc degenera?tion,IDD）作為一種常見的骨關節(jié)疾病，是導致椎間盤突出、腰椎滑脫和椎管狹窄甚至造成殘疾的主要原因，嚴重影響患者健康并降低患者生活質量，給社會帶來了巨大的醫(yī)療和經濟負擔，但其發(fā)病機制尚不明確［1］。目前研究顯示，椎間盤退行性病變與衰老、過度體力勞動、炎性細胞因子以及遺傳因素有關，其中炎癥因子激活導致的細胞凋亡是導致疾病發(fā)病主要因素［3］。半胱氨酸天冬氨酸酶（caspase）家族激活所導致的細胞凋亡是導致椎間盤退行性疾病的主要原因［4］。

半胱氨酸天冬氨酸酶家族是一個高度同源的蛋白質家族。Caspase-3是從人T淋巴細胞中克隆到的Caspase家族成員，在胞漿中作為一種非活性的前體酶存在，Caspase-3的激活導致質膜脫落、染色質凝聚、DNA斷裂［5］。研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-3可作為治療IDD靶點改善椎間盤退行性病變癥狀［6］。而TRAIL是屬于TNF超家族的一種氨基酸Ⅱ型跨膜蛋白，在轉化細胞和癌細胞中TRAIL可優(yōu)先通過TRAIL-R2/DR5 和 TRAIL-R1/DR4 受體誘導細胞凋亡［7，8］。TRAIL基因在人椎間盤中的表達與IDD有關，提示TRAIL基因可能在IDD發(fā)病機制中起一定作用。

細胞凋亡主要包括線粒體途徑和死亡受體途徑。在細胞凋亡的信號作用下，線粒體中凋亡因子內激活，改變線粒體膜通透性，大量凋亡因子被釋放，激活caspese-3蛋白對底物切割，引起凋亡。在死亡受體途徑中，TRAIL被激活后，誘導Fas相關死亡結構域蛋白 （Fas-associated death domain,FADD）、cas?pese-8與死亡受體DR4和DR5結合形成死亡誘導信號復合物（death-inducing signaling complex,DISC），觸發(fā)細胞凋亡。因此，本研究探討TRAIL和Cas?pase-3與IDD發(fā)病的關系，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與處理

選用雄性SD大鼠（濰坊醫(yī)學院動物實驗中心提供），體重 （400.56±30.14）g，共10只。所有大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，采用彎曲鼠尾法建立椎間盤退變模型。造模后單籠喂養(yǎng)，每日觀察鼠尾U型固定器，若固定器脫落再次進行固定。造模8周后隨機選取5只大鼠進行腰椎X線檢測。大鼠腰椎X線顯示脊柱腰段向一側成S狀側彎，判斷本次造模成功。造模成功后繼續(xù)喂養(yǎng)4周，將小鼠麻醉后，取得椎間盤組織，處死。PBS液漂洗大鼠尾椎間盤中髓核組織；采用眼科剪，將髓核組織剪碎至0.1 mm3的小碎塊；加入3 mg/mlⅠ型膠原酶和4 mg/ml消化酶，至于溫箱中消化4 h；將消化混合液進行離心，使用10%血清DMEM培養(yǎng)基重懸，將細胞懸浮液加入到培養(yǎng)皿中，置于5%CO2，37℃的溫箱中過夜培養(yǎng)；當原代細胞從髓核組織塊邊緣逐漸生長出來，用無菌PBS進行沖洗，然后使用0.25%胰酶消化處理，約有80%的貼壁細胞脫落時，終止消化，離心并重懸細胞，按照106/ml的細胞密度重新接種于培養(yǎng)皿中；待細胞生長達到培養(yǎng)皿底部約80%匯合率時收獲細胞進行相關實驗。

1.2 細胞分離與培養(yǎng)

髓核組織用消化酶消化后，分離出髓核細胞，用10%胎牛血清（美國Invitrogen公司）的DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）進行沉淀，記為原代（P0）。加入0.25%胰蛋白酶（美國Gibco公司）2 ml，當細胞突起回縮、變圓、細胞間隙變大，按1∶4傳代接種到新的培養(yǎng)皿中，細胞計數(shù)并調整細胞密度。

1.3 細胞分組處理

P1細胞分為4組，分別為空白對照組（control組）、TRAIL-siRNA轉染組（siTRAIL組）、TNF-α處理組（TNF-α組）和TNF-α處理+TRAIL-siRNA轉染組（TNF-α+siTRAIL組）。

空白對照組：細胞常規(guī)培養(yǎng)，不行其它干預。

TRAIL-siRNA轉染組：將髓核細胞用0.25%胰蛋白酶消化并計數(shù)后接種于6孔板，以DMEM培養(yǎng)基稀釋 10 μl Lipofectamine 2000～250 μl，加入 0.05 nmol的TRAIL siRNA至250μl DMEM培養(yǎng)基，終濃度為200 nmol/L。1×PBS緩沖液沖洗采用熒光定量PCR檢測髓核細胞中TRAIL的表達，以確定轉染效率。

TNF-α處理組：細胞接種于6孔板，加入濃度為100 ng/ml的TNF-α的低糖DMEM培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)2 d。

TNF-α處理+TRAIL-siRNA轉染組：將髓核細胞用濃度為100 ng/ml的TNF-α處理，培養(yǎng)2 d后，用0.25%胰蛋白酶消化并計數(shù)后接種于6孔板，加入Lipofectamine 2000和TRAIL siRNA DMEM培養(yǎng)基，終濃度為200 nmol/L。1×PBS緩沖液沖洗采用熒光定量PCR檢測髓核細胞中TRAIL的表達，以確定轉染效率。

1.4 檢測方法

1.4.1 MTT檢測細胞活性

將細胞以每孔5×103個細胞接種到培養(yǎng)板。培養(yǎng)48 h后，加新鮮配置的MTT溶液（5 mg/ml）20μl/孔，繼續(xù)孵育4 h。上清液吸除，每孔中加150μl DMSO，室溫，搖床振蕩10 min。490 nm波長，測定各孔光吸收值。

1.4.2流式細胞儀檢測細胞凋亡

細胞收集后并洗滌，用 100 μl的標記溶液FITC-Annexin V和PI溶液重懸細胞，室溫下避光孵育15 min。1 200 r/min，棄上清，重懸。加入熒光染液溶液，4℃孵育20min。BD FACSAria流式細胞儀檢測。

1.4.3細胞總蛋白提取與Western blot分析

收集體外培養(yǎng)的各組細胞，置-80℃冰箱保存。檢測前室溫下自然解凍，制備細胞勻漿。采用8%凝膠，室溫，100 v，電泳90 min。在4℃冰箱中利用濕轉法進行轉印，85 v，90 min。將轉印后的PVDF膜與Caspase-3抗體（1∶500）抗體結合，4℃，12 h。PVDF膜與二抗（1∶2000）結合。進行發(fā)光法應并拍照。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 MTT細胞增殖檢測

MTT法檢測細胞增殖結果見圖1，相較于空白對照組，TRAIL-siRNA轉染組細胞的生長速度（100.75±5.72）%，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），TNF-α處理組細胞的增殖速度（49.19±2.89）%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而TRAIL-siRNA轉染+TNF-α處理組細胞的活性無明顯變化（P>0.05），提示沉默TRAIL的表達能顯著改善TNF-α誘導的細胞活性抑制。

圖1 siRNA沉默TRAIL表達對大鼠髓核細胞活性的影響 注：與對照組相比，*P<0.05

2.2 流式細胞檢測細胞凋亡

流式細胞術檢測細胞凋亡結果見圖2，相較于空白對照組，TRAIL-siRNA轉染組大鼠髓核細胞凋亡無明顯改變（P>0.05），TNF-α處理組細胞的細胞凋亡顯著增加（P<0.05），提示TRAIL-siRNA轉染可抑制TNF-α誘導的細胞凋亡。

圖2 siRNA沉默TRAIL表達對大鼠髓核細胞凋亡的影響

2.3 Wester block檢測Caspase-3蛋白表達

Western blot檢測大鼠髓核細胞中Caspase-3蛋白表達水平的結果見圖3。相較于空白對照組，TRAIL-siRNA轉染組大鼠髓核細胞中Caspase-3活性和表達無明顯變化（P>0.05），TNF-α處理組細胞中Caspase-3的活性和表達明顯升高（P<0.05），而TRAIL-siRNA轉染+TNF-α處理組細胞Caspase-3的活性和表達無明顯變化（P>0.05），提示沉默TRAIL的表達可抑制TNF-α誘導的Caspase-3激活和表達。

圖3 siRNA沉默TRAIL表達對大鼠髓核細胞中Cas?pase-3活性和表達的影響

3 討論

大約40%的30歲以下的人和超過90%的55歲或55歲以上的人群患不同程度的椎間盤退行性病變。我國IDD發(fā)病率呈逐年上升，且呈年輕化趨勢［6］。在多種機制的作用下，椎間盤組織發(fā)生細胞表型改變、凋亡、老化、炎性反應以及細胞外基質成分改變等，最終導致患者出現(xiàn)一系列臨床癥狀［9］。椎間盤細胞結構和功能發(fā)生變化會破壞纖維環(huán)與核之間的邊界導致髓核細胞失水，降低椎間盤的承載能力。隨著生活方式的改變、運動的減少、衰老以及人類生活的加速和長期的工作，椎間盤退行性病變的發(fā)病率不斷上升。椎間盤退行性病變可能導致喪失勞動能力，甚至導致殘疾，已逐漸成為全球公共衛(wèi)生問題之一。

細胞凋亡是細胞內穩(wěn)態(tài)的一個重要過程，在多種臨床疾病中起著重要作用。細胞凋亡是導致椎間盤退行性病變的主要原因，并證實在IDD過程中抑制細胞凋亡是預防或逆轉椎間盤退變的有效途徑［10，11］。Gruber等［12］首次在人體中證實椎間盤細胞存在凋亡現(xiàn)象，經檢測發(fā)現(xiàn)IDD患者60%左右的椎間盤細胞發(fā)生凋亡。

細胞凋亡的過程比較復雜，一般認為凋亡過程主要有兩種途徑，即線粒體途徑和死亡受體途徑。線粒體通路被多種細胞應激和大量凋亡信號激活，對IDD過程中細胞凋亡起著重要的作用。在氧化應激作用下，位于線粒體中的bcl-樣蛋白發(fā)生構象變化導致線粒體通透性改變，線粒體膜電位被下調，線粒體隨后通過釋放細胞色素C，caspase級聯(lián)反應被激活，完成對底物切割，引起凋亡［13］。死亡受體途徑主要由TRAIL/TRAIL-R介導，TRAIL被激活后，誘導Fas相關死亡結構域蛋白（Fas-associated death do?main,FADD）、caspese-8與死亡受體DR4和DR5結合形成死亡誘導信號復合物（death-inducing signal?ing complex,DISC），觸發(fā)細胞凋亡［14］。

多種異常刺激可以增加髓核細胞中的炎性因子（如IL-1β和TNF-α）表達，從而引起髓核細胞合成代謝與分解活性的失衡，加速了椎間盤退變。同時也有研究證實，高水平的TNF-α可以激活內源性和外源性途徑中的Caspase-3蛋白發(fā)揮凋亡作用，因此本研究選擇TNF-α作為誘導髓核細胞凋亡的刺激性因子［15］。

本次研究結果發(fā)現(xiàn)，經TNF-α處理后細胞增殖明顯降低，細胞凋亡顯著升高，Western blot檢測結果顯示TNF-α處理組細胞的Caspase-3蛋白明顯高于其他組。此外本次研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL-siRNA轉染+TNF-α處理組細胞的活性、凋亡率及Caspase-3蛋白水平與對照組無明顯差異，提示siRNA沉默TRAIL表達可抑制TNF-α誘導的細胞凋亡，并可顯著抑制TNF-α誘導的Caspase-3激活和表達。由此本次研究認為，TRAIL和Caspase-3蛋白通過參與髓核細胞的凋亡而引發(fā)腰椎間盤退變。TRAIL是一種凋亡分子，能與死亡受體特異性結合后選擇性誘導細胞凋亡。Caspase-3蛋白具有剪切DNA蛋白片段的功能，是調控細胞凋亡的關鍵因子。Sun等［16］研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL可激活死亡受體而啟動外源性凋亡途徑誘導髓核細胞凋亡，與本次研究結果相一致，并認為抑制TRAIL基因的表達使ERK通路失活，成為臨床治療IDD的潛在治療靶點。與先前研究相一致的是，caspase-3在內源性（線粒體）細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，短期抑制caspase-3可用于治療損傷誘導的椎間盤退行性病變［6］。

簡而言之，本研究通過觀察TRAIL沉默后大鼠髓核細胞生物學特性的變化情況，表明TRAIL基因和Caspase-3蛋白誘導的凋亡途徑參與了腰椎間盤的退變。