朱 勇，魯正學(xué)，侯 婧

經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(transcatheter arterial chemoembolization, TACE)可通過栓塞靶血管引起腫瘤組織缺血壞死，是肝癌重要的微創(chuàng)介入策略；但不同患者治療反應(yīng)性不同，其中未獲緩解及治療后復(fù)發(fā)成為影響預(yù)后主要因素；因此準(zhǔn)確評(píng)估肝癌TACE患者治療反應(yīng)性，早期預(yù)測(cè)TACE后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)對(duì)指導(dǎo)臨床決策、調(diào)整治療方案等意義重大[1]。D-二聚體(D-D)在原發(fā)性肝癌患者中水平顯著高于健康對(duì)照者，并與預(yù)后有關(guān)[2-3]。程序性死亡受體-1(PD-1)/程序性死亡受體-配體1(PD-L1)及其介導(dǎo)的協(xié)同刺激信號(hào)參與機(jī)體免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，與肝癌癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為有關(guān)，可能參與了肝癌發(fā)病、進(jìn)展[4-5]。微小RNA-16(miR-16)過表達(dá)能通過阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路，抑制肝癌細(xì)胞的生長與侵襲[6]。目前關(guān)于D-D、PD-1/PD-L1、miR-16與肝癌TACE治療反應(yīng)性的關(guān)系及聯(lián)合預(yù)測(cè)TACE后復(fù)發(fā)的報(bào)道鮮見，本研究對(duì)此進(jìn)行探討，以期為臨床肝癌的治療和預(yù)后評(píng)估提供參考。

1 資料和方法

1.1臨床資料 選取2017年4月—2020年5月我院收治行TACE治療的169例肝癌為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合原發(fā)性肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；行TACE治療者；肝功能Child-Pugh分級(jí)A或B級(jí)；TACE前無肝癌相關(guān)治療；患者知曉本研究，自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：白細(xì)胞<3×109/L；有出血傾向者；嚴(yán)重腹水者；門靜脈主干完全栓塞者；腎功能嚴(yán)重不全者；嚴(yán)重黃疸者；碘過敏者；急性感染者；血液系統(tǒng)疾病者；其他原發(fā)性惡性腫瘤者。本研究獲我院倫理委員會(huì)審核通過。TACE治療后完全緩解55例，部分緩解38例，穩(wěn)定61例，進(jìn)展15例。根據(jù)治療反應(yīng)性分為緩解組93例和非緩解組76例。緩解組男50例，女43例；年齡(62.28±11.47)歲；病因：病毒性肝炎75例，酒精性肝炎12例，其他6例；肝功能Child-Pugh分級(jí)：A級(jí)79例，B級(jí)14例；并發(fā)癥：門靜脈高壓6例，輕度腹水4例；體質(zhì)量指數(shù)(24.16±1.76)kg/m2；既往病史：高血壓病5例，糖尿病9例，冠心病4例；臨床分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期59例，Ⅲ期32例。非緩解組男34例，女42例；年齡(65.09±10.56)歲；病因：病毒性肝炎66例，酒精性肝炎7例，其他3例；肝功能Child-Pugh分級(jí)：A級(jí)69例，B級(jí)7例；并發(fā)癥：門靜脈高壓1例，輕度腹水2例；體質(zhì)量指數(shù)(23.97±2.41)kg/m2；既往病史：高血壓病2例，糖尿病4例，冠心病1例；臨床分期：Ⅰ期1例，Ⅱ期53例，Ⅲ期22例。2組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1治療方法：所有患者均接受TACE微創(chuàng)介入治療。仰臥位，局部麻醉，Seldinger技術(shù)穿刺右股動(dòng)脈，置入5F導(dǎo)管鞘，插5F RH肝管至肝總動(dòng)脈實(shí)施造影，觀察腫瘤位置、數(shù)量、范圍、供血?jiǎng)用}，2.7F微導(dǎo)管選擇至供血?jiǎng)用}，注入化療藥物，將超液化碘油與表柔比星10～20 mg混合后栓塞腫瘤靶血管，待局部小門靜脈顯影或瘤體碘油沉積較密時(shí)停止注入，酌情加用吸收性明膠海綿或聚乙烯醇栓塞顆粒。之后給予保肝、護(hù)胃、能量支持、止吐等對(duì)癥處理，每個(gè)治療周期為4～6周，共治療2個(gè)周期。

1.2.2各指標(biāo)檢測(cè)：TACE前采集所有患者外周血5 ml，采用免疫層析法檢測(cè)血漿D-D水平，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+、CD8+ T細(xì)胞表面PD-1、PD-L1水平，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)血清miR-16水平。

1.2.3療效評(píng)估：完成治療周期后1個(gè)月，參考實(shí)體瘤療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)[8]評(píng)估療效，完全緩解和部分緩解納入緩解組，穩(wěn)定和進(jìn)展納入非緩解組，并隨訪3個(gè)月統(tǒng)計(jì)復(fù)發(fā)情況。完全緩解復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)是出現(xiàn)新的病灶，部分緩解、穩(wěn)定復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)是在TACE后出現(xiàn)新的進(jìn)展。比較2組及復(fù)發(fā)、未復(fù)發(fā)患者D-D、PD-1/PD-L1通路指標(biāo)、miR-16水平，分析D-D、CD8+PD-L1、miR-16水平與治療反應(yīng)性相關(guān)性及復(fù)發(fā)的相關(guān)影響因素，并分析各指標(biāo)預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)效能。

2 結(jié)果

2.1緩解期與非緩解期組D-D、PD-1/PD-L1通路指標(biāo)、miR-16水平比較 2組CD4+PD-1、CD8+ PD-1、CD4+ PD-L1水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。緩解組CD8+ PD-L1、D-D低于非緩解組，miR-16高于非緩解組(P<0.05)。見表1。

表1 緩解組與非緩解組原發(fā)性肝癌D-D、PD-1/PD-L1通路指標(biāo)、miR-16比較

2.2D-D、CD8+ PD-L1、miR-16水平與治療反應(yīng)性關(guān)系 D-D、CD8+ PD-L1水平與治療反應(yīng)性呈負(fù)相關(guān)(r=-0.822、-0.742，P<0.01)，miR-16水平與治療反應(yīng)性呈正相關(guān)(r=0.716，P<0.01)。見圖1。

圖1 D-D、CD8+ PD-L1、miR-16與原發(fā)性肝癌治療反應(yīng)的相關(guān)性分析

2.3復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)患者D-D、PD-1/PD-L1通路指標(biāo)、miR-16比較 由于TACE后病情進(jìn)展患者無法評(píng)估復(fù)發(fā)與否，故不納入數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅納入完全緩解、部分緩解、穩(wěn)定共154例。隨訪3個(gè)月3例失訪，將獲訪患者中復(fù)發(fā)22例為復(fù)發(fā)組，未復(fù)發(fā)129例為未復(fù)發(fā)組。與未復(fù)發(fā)組比較，復(fù)發(fā)組D-D、CD8+ PD-L1水平增高，miR-16水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)原發(fā)性肝癌D-D、PD-1/PD-L1通路指標(biāo)、miR-16水平比較

2.4原發(fā)性肝癌復(fù)發(fā)因素分析 以復(fù)發(fā)情況作為因變量，0=未復(fù)發(fā)，1=復(fù)發(fā)。納入D-D、CD8+ PD-L1、miR-16指標(biāo)作為自變量，賦值分別為：D-D≤128.33 μg/L=1，>128.33 μg/L=2；CD8+ PD-L1≤31.18%=1，>31.18%=2；miR-16≤1.02=1，>1.02=2。參考各連續(xù)變量均值進(jìn)行分層，將D-D、CD8+ PD-L1、miR-16轉(zhuǎn)化為二分類變量，應(yīng)用非條件Logistic回歸方程分析，結(jié)果顯示D-D>128.33 μg/L、CD8+ PD-L1>31.18%、miR-16>1.02是原發(fā)性肝癌TACE后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素(P<0.01)。見表3。

表3 影響原發(fā)性肝癌TACE治療后復(fù)發(fā)的多因素Logistic回歸分析

2.5D-D、CD8+ PD-L1、miR-16對(duì)復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè) 以復(fù)發(fā)患者D-D、CD8+ PD-L1、miR-16為陽性樣本，以未復(fù)發(fā)患者D-D、CD8+ PD-L1、miR-16為陰性樣本，繪制各指標(biāo)預(yù)測(cè)TACE后復(fù)發(fā)的ROC，結(jié)果顯示D-D、CD8+ PD-L1、miR-16預(yù)測(cè)原發(fā)性肝癌TACE后復(fù)發(fā)AUC依次為0.774、0.842、0.831；采用SPSS軟件聯(lián)合應(yīng)用ROC理論模式(LogP模式：對(duì)各單獨(dú)應(yīng)用指標(biāo)進(jìn)行綜合回歸，建立Logistic預(yù)測(cè)評(píng)估模型)，結(jié)果顯示D-D、CD8+ PD-L1、miR-16三者聯(lián)合預(yù)測(cè)TACE后復(fù)發(fā)的AUC為0.931。見圖2、表5。

表5 D-D、CD8+ PD-L1、miR-16水平對(duì)原發(fā)性肝癌TACE治療后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)

圖2 D-D、CD8+ PD-L1、miR-16對(duì)原發(fā)性肝癌TACE治療后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)ROC曲線

3 討論

目前評(píng)估原發(fā)性肝癌TACE治療反應(yīng)性及TACE后復(fù)發(fā)的方法較少。D-D是纖維蛋白經(jīng)過活化和水解產(chǎn)生的特異性降解產(chǎn)物之一，可用于評(píng)估機(jī)體是否存在高凝狀態(tài)和繼發(fā)性纖維蛋白溶解亢進(jìn)[9]。既往資料顯示，肝癌介入治療前D-D高于健康體檢者，且介入治療后有效者D-D降低，并低于無效者[10]。本研究結(jié)果顯示，緩解組D-D低于非緩解組，且D-D與原發(fā)性肝癌治療反應(yīng)性呈負(fù)相關(guān)，提示D-D與原發(fā)性肝癌TACE治療反應(yīng)性有關(guān)，D-D水平較低患者從TACE治療中獲益的可能性較大。惡性腫瘤患者血漿D-D水平升高，與腫瘤細(xì)胞表達(dá)促凝活性物質(zhì)和腫瘤細(xì)胞釋放一些細(xì)胞因子，激活了血小板、單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞，使凝血功能增強(qiáng)有關(guān)；且腫瘤細(xì)胞合成纖溶酶原激活物，作用于纖溶酶原，從而導(dǎo)致D-D水平升高[11-12]。D-D水平越高，肝癌病情越嚴(yán)重，TACE根治性難度越大，因此檢測(cè)D-D可評(píng)估TACE治療反應(yīng)性。本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)組D-D高于未復(fù)發(fā)組，檢測(cè)D-D預(yù)測(cè)原發(fā)性肝癌TACE后復(fù)發(fā)的AUC為0.774，提示進(jìn)行D-D檢測(cè)可指導(dǎo)臨床針對(duì)性干預(yù)，改善預(yù)后。

TACE為經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)，PD-L1為程序性死亡受體-配體1，D-D為D-二聚體，miR-16為微小RNA-16，ROC為受試者工作特征

腫瘤細(xì)胞免疫逃逸和異常細(xì)胞信號(hào)通路參與了原發(fā)性肝癌的發(fā)病[13-14]。CD8+ T淋巴細(xì)胞被誘導(dǎo)凋亡是腫瘤免疫逃逸的一個(gè)重要機(jī)制[15]。PD-1/PD-L1是細(xì)胞免疫信號(hào)傳導(dǎo)通路中的信息分子，能通過耦聯(lián)結(jié)合誘導(dǎo)CD8+ T淋巴細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸[16]。本研究結(jié)果顯示，緩解組CD8+ PD-L1低于非緩解組，與程小珍等[17]報(bào)道相似，提示CD8+ PD-L1與TACE療效有關(guān)。PD-1與PD-L1作用后，可抑制T細(xì)胞的增殖和活化，抑制機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，CD8+ PD-L1水平較高患者，腫瘤細(xì)胞能逃離宿主的免疫監(jiān)視和殺傷，呈現(xiàn)出更強(qiáng)的增殖性，因此PD-1/PD-L1成為近年來腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。本研究結(jié)果同時(shí)顯示，CD8+ PD-L1與原發(fā)性肝癌TACE治療反應(yīng)性、復(fù)發(fā)有關(guān)，可見阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路，可促進(jìn)機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫監(jiān)視和殺傷，可能有利于原發(fā)性肝癌TACE療效和預(yù)后的改善，有望成為新型、有效的靶分子。CD8+ PD-L1預(yù)測(cè)TACE后復(fù)發(fā)的AUC為0.842，當(dāng)CD8+ PD-L1>39.36%時(shí)，有足夠的陽性證據(jù)預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)，故應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)監(jiān)測(cè)隨訪和綜合干預(yù)。

miR-16定位人染色體13q14上，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，該基因區(qū)域的缺失與肝癌等多種實(shí)體腫瘤發(fā)病有關(guān)[18]。目前關(guān)于miR-16與肝癌TACE治療反應(yīng)性、復(fù)發(fā)關(guān)系的報(bào)道鮮見。本研究結(jié)果顯示，緩解組miR-16水平高于非緩解組，與治療反應(yīng)性呈正相關(guān)，表明TACE治療前，miR-16水平越高，原發(fā)性肝癌患者從TACE獲益可能性越大。核因子-κB是miR-16的靶基因之一，而抑制核因子-κB已被證實(shí)與肝癌的轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)，故miR-16可能是通過調(diào)控核因子-κB影響原發(fā)性肝癌TACE后治療反應(yīng)性和復(fù)發(fā)的[19-21]；但缺乏更多相似報(bào)道的論證，這一結(jié)論及miR-16影響原發(fā)性肝癌TACE治療反應(yīng)性是否還有其他機(jī)制，仍需后續(xù)的進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)復(fù)發(fā)組miR-16低于未復(fù)發(fā)組，且miR-16預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的AUC為0.831，呈現(xiàn)出一定應(yīng)用價(jià)值，能為臨床預(yù)測(cè)TACE后復(fù)發(fā)提供客觀數(shù)據(jù)參考。

綜上所述，D-D、PD-1/PD-L1、miR-16與原發(fā)性肝癌TACE治療反應(yīng)性及TACE后復(fù)發(fā)有關(guān)，當(dāng)D-D>153.38 μg/L、CD8+ PD-L1>39.36%、miR-16≤0.91時(shí)，能為臨床預(yù)測(cè)原發(fā)性肝癌TACE后復(fù)發(fā)提供客觀、量化的數(shù)據(jù)。