陳汝琬

福州市規(guī)劃設(shè)計(jì)研究院集團(tuán)有限公司

1 引言

自1929年A.Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素以來(lái)，全世界已經(jīng)生產(chǎn)并使用了多種抗生素來(lái)治療由病原菌引起的人類、動(dòng)物和植物的疾病。因此，大量抗生素通過(guò)家庭、醫(yī)院、制藥公司、污水處理廠以及水產(chǎn)養(yǎng)殖和牲畜養(yǎng)殖場(chǎng)的排放物釋放到環(huán)境中。當(dāng)前，抗生素幾乎在世界所有地方的地表水、地下水、土壤、沉積物和生物群中以較高濃度存在，所以抗生素已經(jīng)被列為一種新興的污染物類別[1]。水環(huán)境中存在多種抗生素會(huì)對(duì)水生生物造成生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，并導(dǎo)致水生生態(tài)系統(tǒng)中抗生素抗性基因（ARGs）和抗生素抗性細(xì)菌（ARB）的生成[2]。這種情況引起了人們對(duì)水生環(huán)境中抗生素殘留的嚴(yán)重關(guān)注，盡管我國(guó)對(duì)抗生素藥物的使用進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定，但是抗生素的使用量和應(yīng)用率依舊居高不下，造成了抗生素超量使用，甚至濫用，由此帶來(lái)了嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題也日益突出[3]?？股赜捎诜肿恿枯^大、種類繁多且普遍具有生物毒性，在污水處理過(guò)程中無(wú)法被完全去除，導(dǎo)致經(jīng)常規(guī)污水處理技術(shù)處理后的出水可能具有抑菌性。所以，在抗生素流入濃度較高的污水廠進(jìn)行出水的抑菌測(cè)試很有必要。本文綜述了水環(huán)境中抗生素污染現(xiàn)狀以及實(shí)驗(yàn)室常用的幾種抑菌試驗(yàn)方法。

2 抗生素污染現(xiàn)狀

抗生素是由微生物（包括細(xì)菌，真菌，放線菌）或更高等的動(dòng)植物在其整個(gè)生命中產(chǎn)生的次要物質(zhì)，具有抗病原體或其他活性，并且可能會(huì)干擾其他活細(xì)胞的發(fā)育的化學(xué)物質(zhì)。根據(jù)藥理特性，抗生素可以分為氨基糖苷類，β-內(nèi)酰胺類，糖肽類，大環(huán)內(nèi)酯類，喹諾酮類，磺酰胺類和四環(huán)素類[4]。近年來(lái)，抗生素廣泛用于預(yù)防和治療人類和動(dòng)物的細(xì)菌感染，全球范圍內(nèi)的抗生素使用提高了傳染病的治療率和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)率。但是，抗生素的使用規(guī)模和范圍越來(lái)越廣泛，其造成的污染對(duì)水生環(huán)境和陸地生態(tài)系統(tǒng)的威脅也越來(lái)越嚴(yán)重。人類和動(dòng)物消耗和排泄后，各種形式的抗生素將釋放到環(huán)境中，如圖1所示。據(jù)估計(jì)，2013年我國(guó)向環(huán)境中排放了約53800噸抗生素，這主要來(lái)自水產(chǎn)養(yǎng)殖和畜牧農(nóng)場(chǎng)的廢水以及未經(jīng)充分處理的污水。近年來(lái)，在污水處理廠、河流、湖泊、海洋、地下水、沉積物甚至飲用水中均會(huì)檢測(cè)到各種抗生素[5]。2005年至2016年期間，在我國(guó)的水樣中共監(jiān)測(cè)到超過(guò)90種抗生素，濃度范圍為0.1ng/L~1000ng/L。從地域上來(lái)看，在華北和華東地區(qū)的河流和湖泊中抗生素檢測(cè)濃度較高，這與華北和華東地區(qū)的人口規(guī)模和抗生素使用量情況相一致[1]。

圖1 抗生素進(jìn)入水環(huán)境途徑

環(huán)境中抗生素的殘留非常有利于ARB和ARGs的發(fā)展和傳播，從而導(dǎo)致了抗生素抗性病原體的增加，會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重影響。同時(shí)，世界衛(wèi)生組織認(rèn)為能夠引起感染的ARB也對(duì)人類健康有著巨大的潛在威脅。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，含抗生素廢水大量流入污水處理廠。由于細(xì)菌密度高、營(yíng)養(yǎng)豐富、污染物種類多（包括抗生素、殺菌劑、藥物和重金屬等），城市污水為ARB的繁殖提供了適宜的條件。此外，污水處理廠中還存在與人類共生和環(huán)境相關(guān)的微生物群，促進(jìn)了ARGs的共享，甚至引入了對(duì)致病微生物的新抗性機(jī)制[6]。因此，在污水處理廠出水指標(biāo)檢測(cè)時(shí)進(jìn)行抑菌性試驗(yàn)，對(duì)出水進(jìn)行抑菌性測(cè)試非常有必要。

3 抑菌試驗(yàn)

抑菌試驗(yàn)是用于測(cè)定抗菌藥物體外抑制細(xì)菌生長(zhǎng)效力的試驗(yàn)，各種抑菌試驗(yàn)廣泛應(yīng)用于新開(kāi)發(fā)的防腐劑、抗菌劑、植物精油以及藥物等多個(gè)領(lǐng)域。液體培養(yǎng)基法、固體培養(yǎng)基法和高通量篩選法是三種常見(jiàn)的體外抑菌試驗(yàn)方法[7]。

3.1 液體培養(yǎng)基法

液體培養(yǎng)基法是將液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基用于細(xì)菌培養(yǎng)的一種方法，常用方法包括濁度法、微肉湯稀釋法和營(yíng)養(yǎng)物消耗法。這種方法相對(duì)易于操作，結(jié)果直觀易觀察，適用于高溶解度藥物的檢測(cè)。在環(huán)境領(lǐng)域中，測(cè)試處理后水體的抑菌性會(huì)用到比濁法，將抑菌效果轉(zhuǎn)移至吸光度，可以通過(guò)吸光度的改變判斷抑菌性的高低。Snowberger等人利用比濁法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，以大腸桿菌為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星、沙拉沙星和諾氟沙星這三種產(chǎn)品抗生素的抑菌效力與母體氟喹諾酮類藥物的抑菌效力相當(dāng)或更高，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了在紫外降解抗生素過(guò)程中要考慮抗生素中間轉(zhuǎn)化的重要性[8]。

3.2 固體培養(yǎng)基法

固體培養(yǎng)基法是將瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌培養(yǎng)的一種方法，一般的方法包括擴(kuò)散法、菌落計(jì)數(shù)法和藥敏平板法。此類方法具有很高的準(zhǔn)確性，可重復(fù)性，易于操作且成本較低[9]。在環(huán)境水樣測(cè)試中，擴(kuò)散法最常用于測(cè)試抗菌性能。這是因?yàn)閿U(kuò)散耗材簡(jiǎn)單易用，并且結(jié)果明顯可區(qū)分。擴(kuò)散法主要包括紙擴(kuò)散法、牛津杯法和打孔法。紙擴(kuò)散法（也稱為K-B法）通常包括對(duì)圓形濾紙進(jìn)行滅菌和干燥，將滅菌的濾紙浸入待測(cè)抗菌溶液中，然后將其置于測(cè)試板上進(jìn)行培養(yǎng)。具體的操作方法如下：將無(wú)菌濾紙放在待測(cè)溶液的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，在整個(gè)無(wú)菌操作過(guò)程中取出藥紙，擦去多余的溶液并將其黏在固體表面上。輕輕按壓濾紙，使濾紙與培養(yǎng)基緊密接觸。通過(guò)將培養(yǎng)皿在37°C的恒溫培養(yǎng)箱中放置24小時(shí)并觀察藥紙周圍的抑菌區(qū)域的大小來(lái)確定溶液的抑菌性。

牛津杯法是使用牛津杯進(jìn)行擴(kuò)散試驗(yàn)的方法，將一定量的待測(cè)試抗菌溶液注入牛津杯中，進(jìn)行培養(yǎng)和觀察。具體的操作方法如下：將無(wú)菌牛津杯放在酒精燈的火焰上，快速加熱以對(duì)其進(jìn)行消毒，然后將牛津杯垂直于培養(yǎng)基表面放置，然后輕輕按壓以確保杯底與培養(yǎng)基無(wú)縫貼合。將相同量的待測(cè)溶液注入每個(gè)牛津杯中。對(duì)于對(duì)照試驗(yàn)，可以添加相同量的鹽水，并在37°C培養(yǎng)24小時(shí)，通過(guò)觀察牛津杯周圍抑制區(qū)的大小反應(yīng)溶液的抗菌性。

打孔法是用滅菌后的鋼管在試驗(yàn)平板上打孔，挑去培養(yǎng)基小塊以做成圓孔，向孔中注入一定量的待測(cè)抑菌溶液后進(jìn)行培養(yǎng)觀察。具體操作方法為：在制備好的固體平板上，利用滅菌后的打孔器垂直打出大小完全相同的幾個(gè)小孔，保證孔的分布均勻，與培養(yǎng)皿邊界保持15mm以上距離。用滅菌牙簽將瓊脂塊挑出。在每個(gè)孔注入等量待測(cè)溶液，37°C培養(yǎng)24小時(shí)，通過(guò)觀察孔周圍抑菌圈的大小來(lái)判斷出水的抑菌性[10]。

K-B和牛津杯方法的誤差相比于打孔法要高很多，這是由于K-B和牛津杯方法從介質(zhì)表面向外圍呈球形擴(kuò)散（見(jiàn)圖2），擴(kuò)散程度與培養(yǎng)基厚度直接相關(guān)。介質(zhì)越厚，表面和底部的擴(kuò)散率差異越大，表面和底部抑制區(qū)的直徑相差越大。而打孔法中待測(cè)溶液在培養(yǎng)基周圍均勻分布（見(jiàn)圖2），從而使培養(yǎng)基表面和底部的抑制區(qū)域大小相等，并避免了測(cè)量誤差[11]。Geng等人利用了打孔法檢測(cè)了利用真空紫外/紫外降解喹諾酮類抗生素中間產(chǎn)物的抑菌能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用真空紫外/紫外工藝中間產(chǎn)物的抗菌活性會(huì)低于紫外工藝的抗菌活性[12]。

圖2 不同擴(kuò)散方法的滲透方式

3.3 高通量篩選法

高通量篩選是一種快速鑒定細(xì)菌和藥物敏感性的檢測(cè)方法。這種方法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)過(guò)程周期短，分析準(zhǔn)確，可以高通量檢測(cè)和篩選，并且克服了傳統(tǒng)抗菌活性篩選過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)的問(wèn)題，減小了勞動(dòng)強(qiáng)度和材料消耗，是目前研究藥物對(duì)細(xì)菌敏感性流行的檢測(cè)方法[7]。但高通量?jī)x器耗材昂貴、成本高，并不適用于環(huán)境領(lǐng)域中應(yīng)用到的低精度的抑菌實(shí)驗(yàn)。

3.4 定性與定量試驗(yàn)

根據(jù)抑菌試驗(yàn)測(cè)試需求的不同，抑菌試驗(yàn)可以分為定性試驗(yàn)和定量試驗(yàn)兩種形式。定性試驗(yàn)常用瓊脂擴(kuò)散法，包括以上介紹的濾紙片法、平板打孔法、牛津杯法等，試驗(yàn)精度較低。定量試驗(yàn)常用最小抑菌濃度測(cè)定試驗(yàn)，針對(duì)不溶性抑菌物采用瓊脂梯度稀釋法，針對(duì)可溶性抑菌物采用營(yíng)養(yǎng)肉湯梯度稀釋法。定量試驗(yàn)時(shí)需要取若干個(gè)試管，分別編號(hào)，將目標(biāo)菌種濃度進(jìn)行梯度稀釋，37℃培養(yǎng)24h后，觀察比較每個(gè)試管中培養(yǎng)液渾濁度。無(wú)菌落長(zhǎng)出的試管中培養(yǎng)液澄清，有菌落長(zhǎng)出的試管中培養(yǎng)液渾濁。產(chǎn)生渾濁液的最低濃度則為最小抑菌濃度，稀釋梯度越密集測(cè)試精度越準(zhǔn)確[10]。

4 結(jié)束語(yǔ)

現(xiàn)如今，抗生素對(duì)水環(huán)境污染嚴(yán)重，污水廠長(zhǎng)期滯留在其中不僅抑制活性污泥的生物活性，還會(huì)產(chǎn)生高排放污染物。在廢水和活性污泥中經(jīng)常檢測(cè)到ARB，這些類型的ARB如果成為生活污水中的優(yōu)勢(shì)菌群，會(huì)導(dǎo)致橫向基因轉(zhuǎn)移，入侵到人和動(dòng)物中，誘導(dǎo)形成嚴(yán)重的耐藥性，使抗生素對(duì)人和動(dòng)物致病菌治療能力大大降低。本文綜述了水體中抗生素污染現(xiàn)狀和抑菌試驗(yàn)的幾種試驗(yàn)方法，這些抑菌試驗(yàn)操作方式簡(jiǎn)單，試驗(yàn)原料易取得，適用于對(duì)于精度要求不高的水處理試驗(yàn)，對(duì)污水處理廠出水增設(shè)抑菌性測(cè)試可以減少含抗生素廢水對(duì)環(huán)境和生態(tài)的進(jìn)一步影響。