武小霞 崔紀(jì)超 鐘玉揚(yáng) 余金姜 顏墩煒 朱錦樂(lè) 鄭建揚(yáng) 中奕

(1莆田市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 福建莆田 351144;2莆田市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站 福建莆田 351100)

甘薯［Ipomoea batatas（L.）Lam．］起源于熱帶南美洲地區(qū)，在100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛種植，是世界第七大重要農(nóng)作物，中國(guó)第四大重要糧食作物，在基本谷物食品短缺時(shí)期，成為許多中國(guó)人的主要食物來(lái)源［1-2］。中國(guó)甘薯種植面積和總產(chǎn)量均為世界第一［3-4］，但目前育成的甘薯品種中，幾乎都有南瑞苕和勝利百號(hào)的血緣，狹窄的遺傳基礎(chǔ)導(dǎo)致選育突破性的新品種較為困難［5-6］。分子標(biāo)記有助于了解甘薯遺傳背景和品種間差異，為種質(zhì)資源的合理利用提供參考依據(jù)［7］。ISSR（Inter simple sequence repeat）分子標(biāo)記由于其簡(jiǎn)單、快速、高效、可重復(fù)性較高的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用［8］。宋吉軒等［9］利用ISSR分析貴州甘薯地方品種遺傳多樣性，明晰其親緣關(guān)系；張安世等［10］采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建22個(gè)甘薯品種的指紋圖譜；羅文彬等［11］明確了34份具有代表性的甘薯種質(zhì)材料的遺傳背景；李強(qiáng)等［12-13］分析了62份甘薯主要親本及中國(guó)26份主要育成品種的遺傳多樣性，明確了其遺傳差異。同時(shí)，ISSR標(biāo)記也在不同類(lèi)型的甘薯中得以應(yīng)用，如陳新起等［14］分析了10個(gè)菜用甘薯材料的遺傳多樣性和親緣關(guān)系；季志仙等［15］將17份材料劃分為4個(gè)組群，表明甘薯主要食用品種間具有較好的遺傳多樣性；研究表明，紫薯和紅黃薯具有明顯不同的來(lái)源和系統(tǒng)演化關(guān)系［16］。目前對(duì)福建省甘薯育成品種親緣關(guān)系沒(méi)有系統(tǒng)的研究。本研究利用ISSR分子標(biāo)記對(duì)福建省甘薯育成品種進(jìn)行遺傳多樣性和聚類(lèi)分析，明晰其親緣關(guān)系，進(jìn)而為提高甘薯育種效率及育種過(guò)程親本的選配提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

20份甘薯品種（表1）種植于福建省莆田市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所清前試驗(yàn)基地。

表1 二十份甘薯品種信息

1.1.2 儀器及試劑

高通量組織研磨儀（美壁MB-48）、水平電泳槽（DYCP-33A，北京六一有限公司）、移液器（Eppendorf，德國(guó)）、PCR儀（GENESY96T）、離心機(jī)（TCL-16M）、冰箱（SIEMENS，德國(guó)）、紫外分光光度計(jì)（UVmini-1240，日本島津）和凝膠成像分析系統(tǒng)（BIO-RAD GELDOCTMXR+，美國(guó)）。磁珠法基因組DNA抽提試劑盒、ISSR引物、瓊脂糖B、5XTBE緩沖液、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker、Taq PCR Mix預(yù)混液（2×，不含染料）和4S Gel Red核酸染料均采購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 甘薯基因組DNA的提取

用磁珠法基因組DNA抽提試劑盒（植物）提取甘薯新鮮葉片總DNA，用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度及純度，保存于-20℃冰箱備用。

1.2.2 ISSR引物篩選

ISSR引物來(lái)源于已報(bào)道的甘薯資源中使用的ISSR引物，以4個(gè)樣品DNA模板進(jìn)行初篩，選擇多態(tài)性豐富、條帶較為清晰的引物。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系50μL：DNA模板2μL，ISSR引物4μL，Taq PCR Mix預(yù)混液（2×，不含染料）25μL，蒸餾水19μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃1 min，54℃45 s（依據(jù)引物而定），72℃1.5 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離檢測(cè)后，用凝膠成像儀拍照。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

用Image Lab軟件對(duì)擴(kuò)增條帶進(jìn)行讀帶，某一位置有擴(kuò)增條帶記為“1”，無(wú)擴(kuò)增條帶記為“0”，將統(tǒng)計(jì)結(jié)果用NTSYS 2.10進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR引物篩選

4份品種的DNA對(duì)已報(bào)道的甘薯ISSR引物進(jìn)行初篩，最終選擇出多態(tài)性豐富、條帶較為清晰的6個(gè)引物（表2），對(duì)20份甘薯材料進(jìn)行擴(kuò)增。

2.2 ISSR引物多態(tài)性信息

6個(gè)引物共獲得擴(kuò)增條帶88條，多態(tài)性條帶74條（表2），多態(tài)率達(dá)84.091%。其中引物UBC859擴(kuò)增條帶最多，為17條；引物UBC899和UBC900擴(kuò)增條帶均為16條，多態(tài)率可達(dá)100%，部分引物擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

表2 ISSR引物信息

圖1 部分引物擴(kuò)增結(jié)果

2.3 聚類(lèi)分析

20份甘薯品種間的遺傳相似系數(shù)在0.636～0.886（表3），平均遺傳相似系數(shù)為0.744，表明這些甘薯育成品種間遺傳關(guān)系較近。福菜薯18號(hào)和泉薯10號(hào)相似度最大，達(dá)0.886；金山75和龍薯601、莆紫薯18相似度最低，表明其遺傳差異相對(duì)較大。

聚類(lèi)分析表明，基于6個(gè)ISSR分子標(biāo)記，在遺傳相似系數(shù)為0.715時(shí)，可將20份甘薯育成品種分為三類(lèi)（圖2），其中莆紫薯18為第一類(lèi)，金山75為第二類(lèi)，其余均被分到第三類(lèi)。莆紫薯18親本為夏引1號(hào)集團(tuán)雜交中間材料和泉薯2號(hào)。夏引1號(hào)由美國(guó)夏威夷引進(jìn)，可能由于地域相差較遠(yuǎn)，故獨(dú)自為一類(lèi)。金山75為金山57放任授粉，其它品種親本材料中也有金山57的血緣，如龍薯15號(hào)和龍薯9號(hào)，但金山75獨(dú)自為一類(lèi)，有可能是各育種單位在相互引種的過(guò)程中導(dǎo)致材料的混雜。福寧紫3號(hào)和福薯404，龍薯601和龍薯9號(hào)，莆薯16和莆薯20可能由于地域較近聚在一起；福菜薯18號(hào)和泉薯10號(hào)由不同育種單位選育，但可能由于母本均為泉薯系列，遺傳背景較為相似，故聚在一起；龍薯15號(hào)和龍薯9號(hào)親本來(lái)源均為巖薯5號(hào)/金山57，但其聚類(lèi)結(jié)果相差較遠(yuǎn)。由于甘薯為同源六倍體，基因組較大，為更加全面地利用甘薯基因組的信息，應(yīng)增加分子標(biāo)記的數(shù)量，同時(shí)結(jié)合其它類(lèi)型的分子標(biāo)記，使得聚類(lèi)分析結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。

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圖2 甘薯育成品種的聚類(lèi)分析結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

本研究分析了20份福建省2000年以來(lái)的育成品種，涵蓋福建省各甘薯育種單位、各種類(lèi)型的甘薯種質(zhì)資源。通過(guò)ISSR標(biāo)記對(duì)這些品種資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，6個(gè)引物共獲得擴(kuò)增條帶88條，多態(tài)性條帶74條，多態(tài)率達(dá)84.091%，這些資源間平均遺傳相似系數(shù)為0.744，遺傳關(guān)系較近。

近年來(lái)分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于甘薯資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系的研究中，以期為甘薯的資源鑒定和育種改良提供分子水平的技術(shù)支撐。不同類(lèi)型甘薯種質(zhì)資源的遺傳距離不同，基于ISSR分子標(biāo)記，來(lái)源于四川、廣西、山東、河南、江蘇、廣東和福建等84份育成品種的平均遺傳距離為0.167 0，主要來(lái)源于福建、廣東和廣西的28份地方品種的平均遺傳距離為0.196 8；12份引自日本、菲律賓和美國(guó)等地的引進(jìn)品種的平均遺傳距離為0.179 1［17］。張超凡等［18］的研究中，11份湖南甘薯育成品種平均遺傳距離0.511 5；20份湖南甘薯地方品種間平均遺傳距離0.524 0。相對(duì)于引進(jìn)品種和地方品種，中國(guó)育成品種遺傳基礎(chǔ)狹窄及骨干基因的單一性，導(dǎo)致育成品種的遺傳多樣性降低［5，15］；但李強(qiáng)等［13］認(rèn)為，來(lái)自亞洲的中國(guó)甘薯主要親本的遺傳多樣性和遺傳差異高于來(lái)自非洲和美洲的，而且提出中國(guó)1990年后育成品種比之前育成品種的遺傳差異有增大的趨勢(shì)。南文卓等［19］研究結(jié)果顯示，30份海南地區(qū)引種甘薯種質(zhì)資源平均遺傳相似性系數(shù)為0.62，認(rèn)為甘薯品種間遺傳多樣性較豐富。蘇一鈞等［20］研究顯示，303份甘薯地方種材料的遺傳距離為0.028～0.947，平均遺傳距離為0.564，認(rèn)為其遺傳多樣性更為豐富。45份貴州甘薯（包含地方和引進(jìn)品種）種質(zhì)資源平均變異系數(shù)為0.4，遺傳關(guān)系較近［9］。趙冬蘭等［21］研究顯示，24份材料的平均相似系數(shù)為0.74，表明中國(guó)的甘薯品種種質(zhì)資源比較豐富；同時(shí)，研究認(rèn)為，不同功能類(lèi)型的甘薯資源遺傳差異較大?；赟SR標(biāo)記的76份紫心甘薯品種表現(xiàn)出一定的分化趨勢(shì)，即遺傳背景有擴(kuò)大的趨勢(shì)［22］。陳新起等［14］研究顯示，10份菜用甘薯種質(zhì)平均遺傳相似系數(shù)為0.645，認(rèn)為其遺傳差異較大。甘薯主要食用品種具有較好的遺傳多樣性［15］。不同的研究對(duì)于甘薯資源遺傳多樣性的看法與結(jié)論不同，可能是因?yàn)檠芯康牟牧项?lèi)型、來(lái)源以及地域背景不同，且所選擇的群體大小有所差異，同時(shí)所應(yīng)用到的分子標(biāo)記種類(lèi)和數(shù)量也有可能導(dǎo)致該現(xiàn)象。本研究中的20份材料均為福建省近年來(lái)的育成品種，且其親本來(lái)源以本省育成品種為主，故其遺傳相似系數(shù)較大，親緣關(guān)系較近。

3.2 結(jié)論

20份福建省育成品種間遺傳相似性較大，親緣關(guān)系較近。在之后的研究工作中應(yīng)純化研究材料，擴(kuò)大群體，增加不同類(lèi)型的種質(zhì)資源，豐富分子標(biāo)記的類(lèi)型與數(shù)量，以便更為全面地分析本省的甘薯資源遺傳關(guān)系。在育種工作中加大親本選擇力度，選擇親緣關(guān)系遠(yuǎn)的親本，創(chuàng)制優(yōu)勢(shì)雜交組合，突破遺傳局限性；同時(shí)應(yīng)充分挖掘地方品種資源的應(yīng)用潛力，特別是其與育成品種間應(yīng)充分發(fā)掘利用。