李依韋，朱思琪，宋美慧，代玉坤

（內(nèi)蒙古民族大學(xué) 生命科學(xué)與食品學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼028043）

茶氨酸最初是在茶葉中分離出來的一種非蛋白質(zhì)氨基酸，其方向均為左旋，又稱為“L-茶氨酸”［1］.它不但可以作為添加劑，而且還具備多種生理功能［2］.它能夠直接對中樞神經(jīng)產(chǎn)生影響，從而調(diào)節(jié)人的情緒，影響學(xué)習(xí)和記憶能力、注意力等，還具有抗腫瘤降血壓等作用［3］.近年來，茶氨酸在醫(yī)療保健方面的開發(fā)更是值得期待，很有可能成為新型安全的天然藥品或保健品，其市場發(fā)展?jié)摿艽螅?］.

化學(xué)合成法生產(chǎn)茶氨酸成本低，但是純化較難，副產(chǎn)物多，安全性無法保證，不適合在食品和醫(yī)藥上應(yīng)用［5］.植物組織培養(yǎng)法獲得茶氨酸對環(huán)境條件要求嚴(yán)格且周期長、產(chǎn)率低，不利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)［6］.而微生物轉(zhuǎn)化法克服了以上2種方法的弊端，是相對合適也是最具有發(fā)展前景的方法.這種方法是用γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）和谷氨酰胺合成酶生產(chǎn)茶氨酸，其中，用γ-GT合成茶氨酸的方法最為簡單有效.γ-GT是普遍存在于微生物和哺乳動物體內(nèi)的一個不對稱的二聚體酶，為轉(zhuǎn)氨酶的一種.

地衣芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性菌，繁殖能力快，形成的芽孢多.具有豐富的酶系且產(chǎn)酶量高、耐熱、安全性高［7］.本研究利用地衣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-GT，再根據(jù)該酶催化γ-谷氨?；鶎ο趸桨返摩?谷氨?；D(zhuǎn)移到雙甘氨肽生成對硝基苯胺，來確定γ-GT酶活力.該高活性的酶能將底物谷氨酰胺中的γ-谷氨?；D(zhuǎn)移到另一底物乙胺鹽酸鹽上，發(fā)酵轉(zhuǎn)化最終獲得茶氨酸.

1 材料與方法

1.1 試驗菌種 地衣芽孢桿菌（內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)與食品學(xué)院微生物生物技術(shù)實驗室保存）.

1.2 試驗方法

1.2.1 繪制地衣芽孢桿菌生長曲線 活化好的地衣芽孢桿菌37℃、180 r?min-1振蕩培養(yǎng).紫外分光光度計每隔2 h在660 nm處測吸光度，建立生長曲線（圖1）.

圖1 地衣芽孢桿菌生長曲線Fig.1 The growth curve of Bacillus licheniformis

1.2.2 紫外分光光度計法制作茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線配制100 μg?mL-1的茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)液.從100 μg?mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別取出1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50 mL，將上述取出的溶液再各加4 mL無菌水、0.5 mL的2%茚三酮溶液、0.5 mL的pH 8.0磷酸緩沖溶液，100℃水浴反應(yīng)15 min冷卻至室溫，超純水定容至10 mL，此時溶液濃度為10.0、12.5、15.0、17.5、20.0、22.5、25.0 μg?mL-1.在570 nm處測各濃度的吸光度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）.線性回歸方程為y=58.716x-0.546，R2=0.999 3，趨勢線可靠性高，可以作為茶氨酸測定標(biāo)準(zhǔn).

圖2 茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of theanine

1.2.3篩選發(fā)酵液中產(chǎn)γ-GT最佳條件以溫度、pH值、接種量、裝液量為因素，按照表1設(shè)計正交試驗篩選發(fā)酵液中產(chǎn)γ-GT最佳條件，發(fā)酵時間均為24 h.取1 mL發(fā)酵液，5 000 r?min-1離心15 min，棄上清液，加3 mL無菌水懸浮菌體，混勻稀釋10倍.取1 mL稀釋液，分別加入0.4 mL γ-谷氨?；鶎ο趸桨贰?.4 mL雙甘肽、1.2 mL Tris-HCL.37℃水浴30 min，405 nm處測對硝基苯胺吸光度.根據(jù)γ-GT（U?mL-1）=D×103×（A1-A2）×Vt/（e×VS×d）計算γ-GT酶活力大?。?-9］，式中，D為稀釋倍數(shù)，A1為樣品吸光度值，A2為空白對照吸光度值，Vt為反應(yīng)總體積，e為摩爾吸光度值（6.22×10-3mol?L-1?cm-2），VS為酶液體積，d為比色皿光位（1 cm）.

表1 正交試驗因素水平編碼Tab.1 Orthogonal experimental factor level coding

1.2.4 篩選轉(zhuǎn)化液中產(chǎn)茶氨酸最佳條件以pH值、谷氨酰胺、乙胺鹽酸鹽、發(fā)酵液量為因素，按照表2設(shè)計正交試驗篩選轉(zhuǎn)化液中產(chǎn)茶氨酸的最佳條件［10］.取1 mL轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液，5 000 r?min-1離心10 min.取上清液，同時加入4 mL水、0.5 mL 2%茚三酮溶液、0.5 mL pH 8.0磷酸緩沖溶液.100℃水浴反應(yīng)15 min后冷卻至室溫，分別定容至10 mL.在570 nm處測茶氨酸吸光度.根據(jù)茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出茶氨酸的產(chǎn)量.

表2 正交試驗因素水平編碼Tab.2 Orthogonal experimental factor level coding

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液中γ-GT酶活力根據(jù)極差Rj=maxKˉij-minKˉij的大小，可以對影響因素排列.Rj越大表明該因素的水平變化對結(jié)果影響越大.影響γ-GT酶活力因素排序為：溫度＞接種量＞pH＞裝液量，分別為溫度28℃、接種量10%、pH 7.0、裝液量30 mL，此時γ-GT酶活力為4.18 U?mL-1（表3）.

表3 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.3 Design and results of orthogonal experiments

續(xù)表3

2.2 轉(zhuǎn)化液中茶氨酸含量根據(jù)表4中Rj的大小，可以得到影響因素排序為：乙胺鹽酸鹽＞發(fā)酵液量＞L-谷氨酰胺＞pH，最佳組合為乙胺鹽酸鹽2.0 mol?L-1、發(fā)酵液量10 mL、L-谷氨酰胺0.45 mol?L-1、pH 9.0，根據(jù)表4和圖2中測定的吸光度值計算茶氨酸量，轉(zhuǎn)化液中茶氨酸的量最大值為0.82 mg?mL-1.圖2茶氨酸計算公式：y=58.716x-0.546.

表4 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.4 Design and results of orthogonal experiments

3 結(jié)論

采用正交試驗法篩選合適的產(chǎn)酶和生產(chǎn)茶氨酸的條件，方法簡單明了且結(jié)果可靠.研究得到地衣芽孢桿菌產(chǎn)γ-GT酶活力最高時的體系為溫度28℃、接種量10%、pH 7.0、裝液量30 mL，此時γ-GT酶活力為4.18 U?mL-1；茶氨酸最佳轉(zhuǎn)化體系為乙胺鹽酸鹽2.0 mol?L-1、發(fā)酵液量10 mL、L-谷氨酰胺0.45 mol?L-1、pH 9.0，此時測得茶氨酸含量為0.82 mg?mL-1.