陳德祥，朱影影，馮承濤

（1.安徽理工大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，安徽淮南233100；2.淮南職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，安徽淮南233100）

羧酸酯酶（Carboxylesterase，CES）是一種典型的水解酶，具有α/β水解酶的顯著特征，屬于α/β水解酶超家族.羧酸酯酶可分為CES1和CES2兩種活性水解酶，其中，CES1主要在肝臟中表達，而CES2則對肝臟和腸道均有非常好的作用.羧酸酯酶是廣泛分布在動物、植物和微生物中水解羧酸酯的酶，在自然界中具有非常重要的作用，尤其在人身體醫(yī)療健康中運用較為廣泛［1］.羧酸酯酶是指作用于可溶性單體底物的酶，其存在于哺乳動物的肝臟中，它不僅可以催化水解環(huán)境中的有毒有害物質(zhì)，還能夠代謝包括前體藥物在內(nèi)的多種藥物，有研究表明該酶在致癌物質(zhì)的水解代謝過程中也發(fā)揮了較大作用，在對維持機體健康方面有較大的幫助［2］.此外，生長發(fā)育的調(diào)節(jié)以及神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞過程中也都伴隨著羧酸酯酶的參與.羧酸酯酶還有合成分解微生物胞內(nèi)脂的功能，能夠有效地避免植物中病原菌對其產(chǎn)生的危害［3］.研究表明，在感染和炎癥等病理情況下，存在肝臟中多種藥物代謝酶的表達水平下降和酶活性水平降低的現(xiàn)象，導(dǎo)致藥物的半衰期延長，從而引發(fā)因血漿藥物濃度上升造成的藥物蓄積毒性反應(yīng).CES屬于I相藥物代謝酶，它廣泛存在于生物體系當(dāng)中，能夠促進酯類和酰胺的水解，主要涉及在生物體內(nèi)代謝與清除多種藥物、致癌物降解和環(huán)境毒素，在保障機體正常發(fā)育和維持身體健康方面發(fā)揮重要作用［4-6］.此外，許多含有羧酸酯結(jié)構(gòu)單元的農(nóng)藥可以被羧酸酯酶水解，利用這一特性可以清除環(huán)境中的農(nóng)藥殘留，更好地維護環(huán)境的生態(tài)平衡，從而達到綠色環(huán)保的目的.

小鼠體內(nèi)表達羧酸酯酶的基因主要由2種羧酸酯酶基因組成，包括羧酸酯酶1（CES1）基因和羧酸酯酶2（CES2）基因，根據(jù)基因在染色體上的位置來對其進行命名，如CES1A、CES1B、…、CES1H等［7］.由于將酯基官能團引入藥物結(jié)構(gòu)中，能夠促進藥物被動轉(zhuǎn)運，提高藥物的口服生物利用度.現(xiàn)如今，基于CES1A表達酶的催化水解活性來設(shè)計藥物的方法已經(jīng)吸引了科研人員的注意，在研發(fā)含有羧酸酯基官能團的前藥中，CES1A發(fā)揮著重要作用.盡管對CES1A表達酶的水解機理還不是很清楚，但越來越多的文獻涉及羧酸酯酶與酯類藥物代謝.在對羧酸酯酶的代謝特征、組織分布、含酯基類藥物設(shè)計等方面進行探索，將為羧酸酯酶的研究發(fā)展奠定堅實的基礎(chǔ).

生物信息學(xué)是一門與其他學(xué)科交互的且具有較好發(fā)展前景的前沿學(xué)科，其中包括對基因組方面以及蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)方面的分析，除此之外還有對藥物先導(dǎo)化合物的設(shè)計和發(fā)現(xiàn)研究［8-10］，極大地拓寬了研究者對生物信息方面知識的了解.筆者利用NCBI、ProtParam、SMART、TMHMM2.0等多個生物信息學(xué)平臺，對小鼠羧酸酯酶的CES1A基因進行生物信息學(xué)分析，探究CES1A基因序列、編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其特征，為研究其功能以及在藥物設(shè)計方面提供一定的線索和依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

借助數(shù)據(jù)庫NCBI（美國國立生物技術(shù)信息中心）檢索小鼠CES1A基因，將其編碼的蛋白質(zhì)序列（NP_001013786.2）和其mRNA序列（NM_001013764.2）分別下載下來，留作備用.

1.2 試驗方法

利用ExPASy數(shù)據(jù)庫分析小鼠CES1A蛋白理化特性［11］.用SOPMA軟件、I-TASSER（https：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/）和SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）軟件分析蛋白結(jié)構(gòu)［12-13］，其中前者用于分析二級結(jié)構(gòu)，后二者用于分析三級結(jié)構(gòu).通過Protscale軟件平臺（https：//web.expasy.org/protscale）預(yù)測所表達蛋白質(zhì)的親水性與疏水性.利用SMART（http//：smart.embl-heidelberg.de/）數(shù)據(jù)庫預(yù)測蛋白的功能結(jié)構(gòu)域［14］.利用STRING（https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖［15］.用SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1）和TMHMM2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM2.0）軟件分析蛋白的信號肽以及跨膜結(jié)構(gòu)［16-17］.利用NetPhos 3.1預(yù)測蛋白的磷酸化位點.利用NetNGlyc 1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc 1.0）預(yù)測蛋白的N-糖基化位點.利用網(wǎng)站（http：//Imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl）進行抗原決定簇預(yù)測［18］.最后將以上所得關(guān)于小鼠CES1A蛋白的基因注釋和結(jié)構(gòu)域等內(nèi)容與UniProtKB（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫所提供的信息進行比對分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠CES1A基因序列分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中，得到小鼠CES1A基因mRNA序列（ID：NM_001013764.2），編碼區(qū)長1 980 bp（位于85～1 776處），以及其編碼的蛋白質(zhì)序列（ID：NP_001013 786.2），共編碼563個氨基酸.

2.2 小鼠CES1A基因表達蛋白理化性質(zhì)分析

經(jīng)過ProtParam軟件分析，小鼠CES1A基因表達蛋白的理化性質(zhì)如下：

1）小鼠CES1A基因表達蛋白的分子式是C2787H4307N711O825S24，其對應(yīng)的相對分子質(zhì)量是61 743.57.

2）小鼠CES1A蛋白的平均親水系數(shù)是－0.081，脂肪系數(shù)是84.67.

3）小鼠CES1A基因表達蛋白的消光系數(shù)是280 nm（M-1/cm），理論等電點為5.13.

4）小鼠CES1A基因表達蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為34.17，由此可知該蛋白在溶液中相對比較穩(wěn)定.

5）小鼠CES1A基因表達蛋白在不同物種中表達半衰期不同：在大腸桿菌體內(nèi)表達半衰期為10 h，在酵母體內(nèi)表達半衰期為20 h，在哺乳動物網(wǎng)狀紅細胞體外表達半衰期為30 h.

6）小鼠CES1A基因表達蛋白的氨基酸組成：占據(jù)比例最少的是半胱氨酸（Cys），只有1.2%；而亮氨酸（Leu）則達到了10.5%，占據(jù)比例最高.

7）小鼠CES1A基因表達蛋白的正負電荷殘基總數(shù)：帶負電荷的殘基總數(shù)為62，主要是天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）；帶正電荷的殘基總數(shù)為45，主要是精氨酸（Arg）和賴氨酸（Lys）.

2.3 小鼠CES1A蛋白結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)是其發(fā)揮生物學(xué)功能的重要影響因素之一.利用SOPMA程序?qū)ES1A基因表達蛋白進行生物學(xué)分析，CES1A基因表達蛋白的二級結(jié)構(gòu)如圖1所示，其結(jié)構(gòu)中包含188個α螺旋（占比為33.39%）、31個β轉(zhuǎn)角（占比為5.51%）、99個延伸鏈（占比為17.58%）以及245個無規(guī)則卷曲（占比為43.52%）.其中：h代表α螺旋，t代表β轉(zhuǎn)角，e代表延伸鏈，c代表無規(guī)卷曲.此外，由I-TASSER和SWISSMODEL軟件對小鼠CES1A蛋白三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)進行進一步分析，發(fā)現(xiàn)分析結(jié)果一致（圖2）.

圖1 小鼠CES1A蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.1 Prediction of the secondary structure of mouse CES1A protein

圖2 小鼠CES1A蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 Fig.2 Prediction of tertiary structure of mouse CES1A protein

2.4 小鼠CES1A蛋白親水性、疏水性分析

為了解小鼠CES1A表達蛋白的親/疏水性，借用Protscale工具對其進行分析，結(jié)果如圖3所示.發(fā)現(xiàn)在第409位點處小鼠CES1A蛋白的親水性最強，得分達到-2.456，在第231位點處疏水性最強，得分為2.711.在該基因編碼的氨基酸中，親水性氨基酸區(qū)域分布少于疏水性氨基酸區(qū)域分布，另根據(jù)氨基酸分值對應(yīng)親水性的規(guī)律［19］，推測該蛋白為親水性蛋白.

圖3 小鼠CES1A蛋白疏水性分析Fig.3 Hydrophobicity analysis of mouse CES1A protein

2.5 小鼠CES1A蛋白功能結(jié)構(gòu)域和基因網(wǎng)絡(luò)通路分析

使用SMART分析小鼠CES1A蛋白功能結(jié)構(gòu)域，如圖4所示，該蛋白僅存在1個保守性結(jié)構(gòu)域，位于第287～301氨基酸殘基處，將所預(yù)測的結(jié)構(gòu)域與UniProtKB數(shù)據(jù)庫提供的CES1基因的結(jié)構(gòu)域進行比對，發(fā)現(xiàn)二者結(jié)果基本一致.利用String數(shù)據(jù)庫檢索CES1A表達的相關(guān)蛋白，將檢索條件設(shè)定為10個蛋白交互，發(fā)現(xiàn)CES1A表達的蛋白與Gnpda1、Pdf、Esd等3個蛋白形成網(wǎng)絡(luò)，并做出相應(yīng)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，如圖5所示.經(jīng)該軟件結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)該PPI網(wǎng)絡(luò)圖共有4個節(jié)點，3條邊，平均節(jié)點度為1.5，PPI濃縮P值為0.565.

圖4 小鼠CES1A蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析Fig.4 Functional structure domain analysis of mouse CES1A protein

圖5 CES1A蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖 Fig.5 The network diagram CES1A protein PPI

2.6 小鼠CES1A蛋白信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

通常情況下，信號肽一般由16～26個氨基酸殘基組成，且位于蛋白質(zhì)的N端［20］.小鼠CES1A蛋白信號肽由SignalP 4.1軟件預(yù)測，結(jié)果見圖6.從圖中可得，綜合剪切位點分值（C值）曲線并無較大的波動，故C值比較平均；Y在10到20之間波動較大；信號肽分值（S值）在剪切位點前后有明顯的變化，在剪切位點之前較高，且趨于平滑，而在剪切位點之后則出現(xiàn)驟降，最終S值接近于0.根據(jù)文獻報道，判斷剪切位點的依據(jù)是Y值的最大值是否大于0.5，結(jié)果顯示，小鼠CES1A基因所表達的信號肽在第1～19位氨基酸之間，故該基因的信號肽切割點在16～17 bp位之間.圖7顯示的是由TMHMM2.0軟件預(yù)測的小鼠CES1A蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，該圖顯示小鼠CES1A蛋白外側(cè)、內(nèi)側(cè)均趨于平穩(wěn)，并不存在跨膜運輸，故不存在跨膜結(jié)構(gòu).

圖6 小鼠CES1A蛋白信號肽預(yù)測Fig.6 Prediction of the signal peptide of mouse CES1A protein

圖7 小鼠CES1A蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 Prediction of the transmembrane structure of mouse CES1A protein

2.7 小鼠CES1A蛋白磷酸化點分析及其N-糖基化位點分析

經(jīng)NetPhos3.1預(yù)測，小鼠CES1A所表達的蛋白共含57個磷酸化位點，分別為26個絲氨酸位點（位于第22、39、76、88、113、123、129、146、150、158、179、185、221、226、228、233、245、314、339、367、375、378、390、405、472和484處），25個蘇氨酸位點（位于第80、81、125、128、151、180、252、259、260、271、289、296、297、319、320、377、387、394、442、461、476、492、530、557和561處），和6個酪氨酸位點（位于第37、112、122、449、471、518和524處）（圖8）.經(jīng)NetNGlyc1.0預(yù)測，小鼠CES1A表達的蛋白含3個N-糖基化位點，如圖9所示，這3個N-糖基化位點分別位于第78、388和489處.

圖8 小鼠CES1A蛋白磷酸化位點預(yù)測Fig.8 Prediction of phosphorylation sites of mouse CES1A protein

圖9 小鼠CES1A蛋白N-糖基化位點預(yù)測Fig.9 Prediction of N-glycosylation sites of mouse CES1A protein

2.8 小鼠CES1A蛋白抗原決定簇分析

利用網(wǎng)絡(luò)在線工具Predicting Antigenic Peptides對小鼠CES1A蛋白抗原決定簇進行預(yù)測，由圖10可知，小鼠CES1A表達蛋白的平均抗原傾向指數(shù)為1.033 0，共含有22個抗原決定簇區(qū)域，分別位于4～31 aa，34～69 aa，83～102 aa，105～121 aa，131～146 aa，151～157 aa，159～176 aa，191～202 aa，211～219 aa，223～237 aa，245～256 aa，263～276 aa，278～286 aa，299～309 aa，313～329 aa，340～348 aa，375～387 aa，391～399 aa，420～434 aa，445～455 aa，466～476 aa位及538～546 aa位氨基酸殘基.以上結(jié)果表明小鼠CES1A蛋白含有較多的優(yōu)勢抗原表位結(jié)構(gòu)，抗原傾向指數(shù)高（圖10）.

圖10 小鼠CES1A蛋白抗原決定簇預(yù)測Fig.10 Prediction of antigenic determinant of mouse CES1A protein

3 討論與結(jié)論

羧酸酯酶能夠催化水解一些酰胺類和酯類化合物，故常常添加到清洗劑中以提升潔凈效果，此外它還對含有相應(yīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥殘留有一定的降解作用，這一特性賦予其在生產(chǎn)和科學(xué)領(lǐng)域有很高的應(yīng)用價值，從而使科研工作者對羧酸酯酶產(chǎn)生了極大的興趣和密切的關(guān)注.目前市場上已經(jīng)存在利用羧酸酯酶來對殘留農(nóng)藥進行降解的肥料和清潔劑產(chǎn)品.為了增加藥物的生物利用度，降低藥物不良反應(yīng)發(fā)生率，以基于羧酸酯酶的前藥活化策略，來進行前藥設(shè)計已經(jīng)逐漸成為新型抗腫瘤藥物的研究熱點，在醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域具有重要意義.

綜上所述，筆者主要運用了NCBI、ProtParam和ExPASy等多個方法和手段，對小鼠CES1A基因的基本性質(zhì)進行了深入研究，研究結(jié)果如下：

1）小鼠CES1A基因編碼區(qū)長1 980 bp，編碼563個氨基酸.其表達蛋白的分子式為C2787H4307N711O825S24，分子質(zhì)量為61 743.57 u，脂肪系數(shù)為84.67.

2）小鼠CES1A表達蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)：該蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋（占比為33.39%）和無規(guī)卷曲（占比為43.52%）構(gòu)成，其在第1~19位氨基酸之間存在信號肽，無跨膜結(jié)構(gòu)，是親水性蛋白.

3）小鼠CES1A表達蛋白質(zhì)有57個磷酸化位點和3個N-糖基化位點，含有22個抗原決定簇區(qū)域.

通過對羧酸酯酶生物信息學(xué)分析，為藥物設(shè)計和藥物代謝機制以及癌癥治療方面提供理論依據(jù)，具有指導(dǎo)意義.