金建華，柳詹，秦世榮

（青海民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，青海 西寧810007）

白刺是蒺藜科白刺屬的落葉小灌木，白刺果實有“沙漠櫻桃”之稱［1-2］，含有多糖、黃酮、多酚、生物堿、花青素、脂肪酸、維生素及礦物元素等成分［3-4］，有抗氧化、生津、養(yǎng)胃健脾、利肺、解郁、化食等功效［5］，其中多糖具有增強機體免疫力、抗自由基［6］、預(yù)防心腦血管疾?。?］、促進機體分泌胰島素［8］、保肝等重要的生物學(xué)功能［9-11］.由此已被廣泛運用到臨床、保健品、餐飲界等領(lǐng)域.目前，多糖有水提法、酶提取法、超聲波提取法等［12-15］，但都存在工藝復(fù)雜、提取周期長、提取率低、多糖活性易被破壞等缺陷.快速溶劑萃取技術(shù)（Fully Automatic Rapid Solvent Extraction，APLE）是新分離方法［16-17］，因其具有提取率高、快速和節(jié)省溶劑、活性成分不易被破壞等優(yōu)點，已應(yīng)用于食品、藥品活性成分的提取和分離［18-19］.

唐古特白刺在青海省柴達(dá)木盆地約23萬hm2，年產(chǎn)量約10～15萬t［20-21］，自然資源豐富，由于產(chǎn)于海拔高、紫外線強、氣候干燥等特殊生態(tài)環(huán)境，其礦物成分、營養(yǎng)成分、功效成分與其他地區(qū)的白刺有一定的差異［22-23］.目前，利用快速溶劑萃取法提取唐古特白刺果實多糖的研究未見報道，抗氧化活性也鮮有探究，為了充分開發(fā)利用唐古特白刺這一資源，筆者研究了快速溶劑萃取法提取唐古特白刺果實多糖的最優(yōu)工藝條件，并分析其抗氧化活性.

1 實驗方法

1.1 材料、試劑與儀器

唐古特白刺果實采于青海省海西州柴達(dá)木盆地，經(jīng)中國科學(xué)院西北高原生物研究所鑒定.

無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）和羥自由基（·OH）等均為分析純.

APLE-2000快速溶劑萃取儀，北京吉天有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理 將新鮮的唐古特白刺果實清洗，于60℃進行干燥、粉碎，過40目的篩子備用.

脫脂：將唐古特白刺果實粉置回流裝置中，在60℃下，用5倍體積石油醚回流2次.

脫單糖：加入8倍體積95%乙醇于濾渣中，75℃進行2次回流，過濾.

1.2.2 APLE多糖的提取 稱取15 g唐古特白刺果實試樣，以蒸餾水為溶劑，在一定的溫度、提取次數(shù)、壓力、時間下，提取多糖，過濾，加4倍體積的無水C2H5OH于濾液，20 h后，過濾，用Sevage法脫去多糖中蛋白，濃縮、用無水C2H5OH洗滌沉淀，干燥制得多糖.

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 將0.250 0 g無水葡萄糖定容于250 mL容量瓶中，配制成1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液.依次向0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液加入2.00 mL5%苯酚溶液，5.00 mL濃H2SO4，搖勻，40℃下恒溫30 min后，在490 nm處測吸光度，以超純水為空白對照，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，曲線方程為：A=1.943 6ρ-0.002 9（R2=0.999 2）.

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

1.2.4 多糖測定 用苯酚-硫酸法測定多糖含量.用超純水定容0.100 0 g唐古特白刺果實多糖于100 mL容量瓶，移取該溶液0.30 mL，按照1.2.3所示及曲線方程測定多糖含量.

1.2.5 APLE提取多糖單因素試驗

1.2.5.1 提取溫度 精確稱取樣品3.000 0g，置于萃取池中，設(shè)定APLE提取多糖時間為12 min、壓力為10 MPa、重復(fù)提取2次，考察溫度對多糖提取率的影響.

1.2.5.2 提取壓力 精確稱取樣品3.000 0g，置于萃取池中，設(shè)定APLE提取多糖2次，在100℃下，考察壓力對多糖提取率的影響.

1.2.5.3 提取時間 精確稱取樣品3.000 0g，置于萃取池中，設(shè)定APLE在10 MPa、100℃下，提取2次，考察時間對多糖提取率的影響.

1.2.5.4 提取次數(shù) 精確稱取樣品3.000 0g，置于萃取池中，設(shè)定APLE多糖提取壓力為10 MPa，溫度為100℃，時間為12 min，考察提取次數(shù)對多糖提取率的影響.

1.2.6 響應(yīng)面法試驗 本研究運用響應(yīng)面優(yōu)化法，設(shè)計了三因素三水平正交試驗，見表1.

表1 試驗因素水平Tab.1 Level of experimental factors

1.2.7 多糖抗氧化活性

1.2.7.1 清除DPPH·的試驗［24-25］.配制DPPH·樣品濃度0.000 2 mol·L-1的C2H5OH溶液；配制0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 mol·L-1多糖溶液.準(zhǔn)確移取2.0 mL的DPPH·C2H5OH溶液分別與2.0 mL不同濃度的多糖溶液混合，避光40 min后，于517 nm處測吸光度A1，按照同樣的方法測定2.0 mL 95% C2H5OH和2.0 mL不同濃度的樣品液的吸光度A2，2.0 mL 95% C2H5OH和2.0 mL DPPH·C2H5OH溶液的吸光度A3.DPPH·清除率Y（%）=1-（A1-A2）/A3×100%

1.2.7.2 ·OH的清除試驗［26］.將2.0 mL 5 mmol·L-1硫酸亞鐵溶液、2.0 mL 5 mmol·L-1過氧化氫溶液依次加入到2.0 mL 0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 mg·mL-1的唐古特白刺果實多糖溶液中，反應(yīng)12 min后，加入2.0 mL 5 mmol·L-1Vc-C2H5OH溶液，35 min后，于510 nm處測吸光度B1，按照同樣的方法測定蒸餾水代替多糖和過氧化氫的吸光度B2，以蒸餾水為空白對照的吸光度B3.

1.2.7.3 還原力試驗［27-28］.在1.0 mL不同濃度多糖溶液中依次加入3.0 mL 0.2 mol·L-1NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液（pH為6.6）和1%K3［Fe（CN）6］溶液，混勻，50℃恒溫30 min，冷卻加入10%三氯醋酸3.0 mL，取混合液3.0 mL，加入0.5 mL 0.1% FeCl3溶液和3.0 mL蒸餾水，混勻，在700 nm處測吸光度.

2 結(jié)果與分析

2.1 APLE提取多糖單因素試驗

2.1.1 提取壓力快速溶劑萃取儀分別設(shè)計提取壓力為6、8、10、12、14 MPa，結(jié)果見圖2.

由圖2知，在10 MPa前，增加提取壓力有利用于多糖的提取，當(dāng)增加到10 MPa時，達(dá)到最大提取率，隨后降低，故選定9、10、11 MPa為響應(yīng)面優(yōu)化工藝因素水平.

圖2 壓力對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of pressure on the extraction rate of polysaccharide

2.1.2 循環(huán)提取次數(shù)快速溶劑萃取儀設(shè)計循環(huán)次數(shù)為1、2、3、4、5次提取多糖，結(jié)果見圖3.

圖3 提取次數(shù)對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction times on extraction rate of polysaccharide

由圖3知，提取次數(shù)對多糖提取率影響不大，故選取提取次數(shù)為2次.

2.1.3 提取時間 快速溶劑萃取儀分別設(shè)計6、8、10、12、14 min提取多糖，結(jié)果見圖4.

從圖4知，隨著提取時間的延長有利于多糖提取，在10 min后逐漸減緩，繼續(xù)延長提取時間對多糖提取的影響不明顯，故選取8、10、12 min為響應(yīng)面優(yōu)化工藝考察水平.

圖4 提取時間對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction times on extraction rate of polysaccharide

2.1.4 提取溫度 快速溶劑萃取儀分別設(shè)計70、80、90、100、110℃提取多糖，結(jié)果見圖5.

圖5 溫度對多糖提取率的影響Fig.5 Effect of temperature on extraction rate of polysaccharide

由圖5知，初始多糖提取率與溫度成正比，100℃后變化不大，因此，選取90、100、110℃為響應(yīng)面優(yōu)化工藝考察水平.

2.2 響應(yīng)面法試驗

2.2.1 結(jié)果及方差分析以多糖提取率作為響應(yīng)值，提取時間、溫度、壓力為影響因子，依據(jù)單因素試驗，進行Box-Behnken響應(yīng)面法試驗設(shè)計，結(jié)果如表2所示.

表2 試驗設(shè)計Tab.2 Test design

利用Design-Expert12軟件對表2數(shù)據(jù)進行分析，建立了影響因子與多糖提取率（Y）的二次回歸模型：

模型的方差分析結(jié)果見表3.

表3 模型分析Tab.3 Model analysis

由表3可知，通過方差分析，該二次多項式回歸模型F值為31.47，P＜0.000 1，表明該模型具有統(tǒng)計顯著性，失擬項P＞0.05，不顯著，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.975 9，變異系數(shù)CV為1.27%<10%，表明該二次多項式回歸模型可信度高，能較好地預(yù)測和分析多糖的提取率.提取溫度、時間、壓力、交互項（AB、AC、BC）及二次項（A2、B2、C2）的P值均小于0.05，說明3個影響因子對多糖的提取率影響顯著，提取溫度最大，影響最小的是提取時間.

2.2.3 因子交互作用分析 在提取多糖時，3個影響因子之間存在顯著的交互作用，圖6（a～c）為影響因子交互作用對多糖提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖.

從圖6（a～c）可以看到，3個因子兩兩之間交互作用的響應(yīng)曲面坡度較陡峭，等高線呈橢圓形，說明3個因子交互作用強，對多糖提取影響大，這與方差分析結(jié)果相符.

2.2.4 工藝優(yōu)化及結(jié)果 工藝優(yōu)化為提取溫度102℃、提取時間10 min、提取壓力10 MPa，提取2次，在該優(yōu)化條件下，重復(fù)進行3次試驗，驗證結(jié)果見表4.

表4 優(yōu)化工藝條件下多糖的提取率Tab.4 Extraction rate of polysaccharides under optimized process conditions

由表4可知，3次重復(fù)性試驗所得多糖提取率平均值為78.15%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.03，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.038%，與模型預(yù)測值78.20%基本相符，優(yōu)化工藝可靠.

2.3 多糖的抗氧化活性

2.3.1 對DPPH·的清除 試驗結(jié)果見圖7.

從圖7可以看出，DPPH·清除率隨著多糖濃度的增加而增大，濃度為0.2 mg·mL-1，DPPH·清除率達(dá)到79.10%，半抑制濃度IC50為0.088 54 mg·mL-1，清除力為VC的0.037倍，對DPPH·有較好的清除力.

圖7 唐古特果實多糖質(zhì)量濃度對DPPH·的清除率影響Fig.7 Effect of polysaccharide quality concentration of Nitraria tangutorun Bobr.fruit on DPPH·clearance rate

2.3.2 對·OH的清除 試驗結(jié)果見圖8.

由圖8知，多糖濃度的升高，對·OH的清除能力增強，其最大清除率為35.31%，VC為99.56%，多糖清除·OH的半抑制濃度IC50為2.549 2 mg·mL-1，VC的IC50為0.107 55 mg·mL-1，VC對·OH的清除力強于唐古特白刺果實多糖.

圖8 唐古特白刺果實多糖質(zhì)量濃度對·OH清除率的影響Fig.8 Effect of polysaccharide quality concentration of Nitraria tangutorum Bobr.on·OH clearance rate

2.3.3 還原力 試驗結(jié)果見圖9.

圖9 多糖還原力Fig.9 Reducing power of polysaccharide

由圖9知，多糖與Vc的還原力均隨質(zhì)量濃度的增大而提高，當(dāng)Vc濃度為0.8 mg·mL-1時，吸光度達(dá)3.01，多糖的吸光度為1.75，二者相比，Vc還原力更強.

3 結(jié)論

采用快速溶劑萃取法和響應(yīng)面法確定：溫度102℃、時間10 min、壓力10 MPa，循環(huán)提取2次，為提取唐古特白刺果實多糖優(yōu)化工藝，此工藝下，多糖提取率可達(dá)（78.15±0.038）%，提取率高、快速、節(jié)省溶劑.提取的多糖對DPPH·和·OH半抑制濃度IC50分別為0.088 54 mg·mL-1、2.549 2 mg·mL-1，清除力強，有較好的還原力和抗氧化活性.