劉洋洋, 周樂豪, 郝夢洋, 蔡海波, 譚文松

(華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室, 上海 200237)

1 前 言

免疫細胞療法已成為治療惡性腫瘤的新希望[1]，其中NK 細胞作為一種以非主要組織相容性復(fù)合體限制(major histocompatibility complex，MHC)方式發(fā)揮其殺傷腫瘤細胞的免疫細胞[2]在臨床上有重要應(yīng)用價值。然而，原代NK 細胞難以獲取和進行體外擴增限制了其臨床應(yīng)用。隨著細胞克隆技術(shù)的發(fā)展，已建立多種NK 細胞系，包括KHYG-1、NK-92、NKL、NKG 和YT 細胞[3-4]，其中NK-92 細胞是一種依賴白細胞介素-2(IL-2)擴增的細胞，抗腫瘤譜廣，表達CD56，不表達CD3，具有強烈的細胞毒性作用[5-6]。NK-92 細胞經(jīng)過基因改造可得到CAR-NK-92 細胞，在臨床上具有極大的應(yīng)用潛能[7-8]。為滿足臨床細胞輸注的要求，NK-92 細胞的體外高效擴增是其臨床應(yīng)用的重要保證。攪拌式生物反應(yīng)器因可提供均勻的培養(yǎng)環(huán)境是進行懸浮細胞體外規(guī)模化擴增的常用裝備[9]。然而攪拌式生物反應(yīng)器在運行過程中會產(chǎn)生流體剪切力，而其剪切力大小會隨攪拌槳槳型的差異而變化[10]。有研究表明常用的螺旋攪拌槳運行時產(chǎn)生的流體剪切力較大，會對剪切力敏感的細胞造成傷害；而球體攪拌可顯著減小流體剪切力的產(chǎn)生[11-12]，避免因剪切力損傷而導(dǎo)致細胞擴增能力的下降。在攪拌式生物反應(yīng)器中，磁力攪拌瓶是通過磁場的變化控制攪拌裝置運動實現(xiàn)培養(yǎng)體系的混合，其流體剪切力的大小同樣受磁性攪拌子形狀和性質(zhì)的影響[13]。為此，研制磁性攪拌珠并通過其有規(guī)律的運動，達到混合培養(yǎng)體系的目的，是設(shè)計磁性生物反應(yīng)器的一個新思路。

海藻酸鈉作為一種從海藻或海帶中提取的天然聚陰離子多糖化合物，具有良好的生物相容性，可以與2 價金屬陽離子(如鈣離子)反應(yīng)形成凝膠球[14]。在海藻酸鈉形成凝膠球的過程中，加入Fe3O4納米顆粒，可制備出磁性攪拌珠[15]。改變海藻酸鈉濃度或2 價陽離子濃度可調(diào)節(jié)磁性攪拌珠的穩(wěn)定性[14,16]。此外，殼聚糖作為天然唯一帶正電荷多糖，可與海藻酸鈉發(fā)生靜電絡(luò)合反應(yīng)[17]。將殼聚糖覆裹于海藻酸鈣凝膠球表面，可有效降低海藻酸鈣凝膠球的孔隙率，減少內(nèi)部物質(zhì)的泄漏[18]，進一步提高磁性攪拌珠的穩(wěn)定性。

本研究采用兩步法制備海藻酸鈉/殼聚糖雙組分磁性攪拌珠[19]，第1 步以海藻酸鈉和Fe3O4制備磁性攪拌珠核，第2 步將殼聚糖覆裹于磁性攪拌珠表面，增強其磁穩(wěn)定性；應(yīng)用于NK-92 細胞體外擴增。根據(jù)細胞總擴增倍數(shù)，細胞表型和殺傷活性探討磁性攪拌珠對NK-92 細胞的擴增的影響，為免疫細胞體外擴增設(shè)備提供技術(shù)支持。

2 材料與方法

2.1 儀器與設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀(Bio Tek，美國)，磁力轉(zhuǎn)瓶機(integra bioscience，瑞士)，電腦控制拉力試驗機(GT-TCS2000，GOTECH，中國)，大口搖瓶(德國VITLAB 公司，容積為100 mL，工作體積為10～50 mL)。

2.2 實驗材料

海藻酸鈉(sodium alginate，Sigma Aldrich，美國)；殼聚糖(chitosan，脫乙酰度95%，黏度100～ 200 mPa·s，上海麥克林生化科技有限公司)；四氧化三鐵(Fe3O4，粒徑100～300 nm，阿拉丁試劑(上海)有限公司)；白介素-2(IL-2)購于美國Pepro Tech 公司；FITC 標(biāo)記的鼠抗人CD3 抗體和PE 標(biāo)記的鼠抗人CD56 抗體購于美國Becton Dickinson (BD)公司；胎牛血清購于Bio Sun 公司；CCK 8 試劑盒，購于東仁化學(xué)科技(上海)有限公司；IMDM 培養(yǎng)基購于美國Thermo 公司；NK-92 細胞來自中科院上海細胞庫；水為雙蒸水。

2.3 海藻酸鈉/殼聚糖雙組分磁性攪拌珠制備

本研究制備海藻酸鈉殼/聚糖雙組分磁性攪拌珠流程如下：首先向30 mg Fe3O4粉末中加入100 μL 水，超聲30 min；加入1 mL 海藻酸鈉溶液，混勻，得到黑色磁性海藻酸鈉溶液，使用200 μL 移液槍吸取該溶液，均勻滴入300 mmol·L-1CaCl2溶液中，置于130 r·min-1搖床上30 min，得到海藻酸鈉磁性攪拌珠核；接著取出海藻酸鈉磁性攪拌珠核，轉(zhuǎn)入質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的殼聚糖溶液中，置于130 r·min-1搖床上1 h，得到海藻酸鈉/殼聚糖雙組分磁性攪拌珠。將磁性攪拌珠用超純水反復(fù)清洗3 遍，除去表面未反應(yīng)的殼聚糖。最后浸泡于培養(yǎng)基中備用。

2.4 磁性攪拌珠溶脹率檢測

將20 個制備好的磁性攪拌珠浸沒于純水中靜置，分別在10，20，40，60，90 和120 min 從純水中取出磁性攪拌珠，用濾紙吸干表面水分，快速稱重，繼續(xù)浸沒于上述純水中。計算不同時間的溶脹率Sw：

式中：mt為20 個磁性攪拌珠溶脹后的質(zhì)量，m0為20 個磁性攪拌珠初始的質(zhì)量。Sw為20 個磁性攪拌珠平均溶脹率。

2.5 磁性攪拌珠浸出液濁度檢測

將14 個磁性攪拌珠放入裝有2 mL IMDM+10% FBS(胎牛血清)培養(yǎng)基的24 孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置20 d。分別在第1、4、7、11、14、17 和20 d 檢測磁性攪拌珠浸出液在450 nm 處的吸光度，以浸出液吸光度的變化評價磁性攪拌珠的穩(wěn)定性。

2.6 磁性攪拌珠機械性能測定

磁性攪拌珠機械性能通過小載荷應(yīng)力應(yīng)變壓縮試驗測定。通過裝有計算機和控制測量系統(tǒng)的機械測試系統(tǒng)(GT-TCS2000，GOTECH，China)進行小載荷應(yīng)力應(yīng)變壓縮試驗。用于試驗的磁性攪拌珠被制成尺寸為10 mm×5.0 mm 的柱形樣品(直徑×厚度)。將所有樣品以1 mm·min-1的速度進行壓縮，壓縮到樣品破裂或壓縮程度達到80% 立即停止。在整個過程中，數(shù)據(jù)的變化直接輸送至顯示器上，在顯示的結(jié)果統(tǒng)計表中可直接讀出磁性攪拌珠應(yīng)力-應(yīng)變及彈性模量。

2.7 NK-92 細胞培養(yǎng)

將NK-92 細胞以5×104cells·mL-1密度接種于IMDM+10% FBS 培養(yǎng)基中，添加1 000 U·mL-1IL-2，于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d。隔天吹散細胞團，采用血球計數(shù)板計數(shù)，計算細胞密度，并添加新鮮培養(yǎng)基和1 000 U·mL-1IL-2，維持細胞密度在2×105cells·mL-1。

實驗組采用磁力攪拌瓶，培養(yǎng)體積10 mL，動態(tài)培養(yǎng)；對照組采用T 25 培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)體積為5 mL，靜態(tài)培養(yǎng)。

2.8 CD3-CD56+細胞比例分析

采用流式細胞術(shù)對細胞表型分析，分析培養(yǎng)8 d 后培養(yǎng)物中CD3-CD56+細胞的比例。收集5×105～1×106個細胞，用10 μL FITC-CD3 和10 μL PE-CD56 的流式抗體標(biāo)記收集的細胞，在4 ℃孵育30 min 后用FASC Callibur(美國BD 公司)進行細胞表型分析，結(jié)果運用FlowJo 軟件進行處理。

2.9 NK-92 細胞殺傷活性

收集培養(yǎng)8 d 后的NK-92 細胞作為效應(yīng)細胞(E)，K562 細胞為靶細胞(T)，采用CCK8 檢測細胞活性，以此評價NK-92 細胞對K562 細胞的殺傷活性。將1×105個NK-92 細胞與1×104個K562 細胞(效應(yīng)細胞和靶細胞個數(shù)比(E/T)為10:1)同時加入0.1 mL IMDM+10% FBS 培養(yǎng)基中作為實驗組，將1×105個NK-92細胞和1×104個K562細胞分別加入上述培養(yǎng)基中作為對照組。在培養(yǎng)箱中孵育24 h 后加入10 μL CCK-8，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h，檢測450 nm 處的吸光度(OD)值，其中1×105個NK-92 細胞、1×104個K562 細胞以及1×105個NK-92 細胞與1×104個K562 細胞共培養(yǎng)檢測得到的OD 值分別是ODE、ODT、ODE/T。根據(jù)下式計算殺傷活性。

2.10 統(tǒng)計分析方法

本研究用T 檢驗(T-test)進行兩組之間的統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示，p＜0.05 代表有顯著差異。

3 結(jié)果與討論

3.1 海藻酸鈉濃度對雙組分磁性攪拌珠穩(wěn)定性的影響

3.1.1 磁性攪拌珠形貌尺寸

磁性攪拌珠形貌如圖1 所示，所得磁性攪拌珠直徑均為3 mm，整體黑亮，粒徑均勻，可見制備的磁性攪拌珠中磁粉分布均勻。磁性攪拌珠表面光滑，在細胞培養(yǎng)中可有效降低剪切力，減少對細胞的傷害。

圖1 磁性攪拌珠形貌Fig.1 Morphology of magnetic stirring beads

3.1.2 磁性攪拌珠溶脹率溶脹率反映磁性攪拌珠的穩(wěn)定性。雙組分磁性攪拌珠制備過程中，海藻酸鈉濃度對磁性攪拌珠溶脹率的影響如圖2 所示。由圖2 可見，隨著海藻酸鈉濃度的提高，溶脹率降低。當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量濃度達到25 mg·mL-1時，磁性攪拌珠溶脹率明顯降低，且繼續(xù)增大海藻酸鈉濃度，溶脹率變化不大，說明制備雙組分磁性攪拌珠時，海藻酸鈉質(zhì)量濃度為25 mg·mL-1較為合適。這可能是因為高濃度的海藻酸鈉與Ca2+形成的蛋殼內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加緊密，減少了水分的進入，束縛磁性攪拌珠的溶脹。

圖2 海藻酸鈉濃度對磁性攪拌珠溶脹率的影響Fig.2 Effects of sodium alginate concentrations on swelling rates of magnetic hydrogel beads

3.1.3 磁性攪拌珠浸出液濁度

將所制備的雙組分磁性攪拌珠浸泡于IMDM+10%FBS 培養(yǎng)基中，檢測浸出液OD 值隨浸泡時間的變化，該指標(biāo)同樣可以反映磁性攪拌珠的穩(wěn)定性。結(jié)果如圖3所示，磁性攪拌珠在培養(yǎng)基中浸泡前期，其浸出液OD值上升趨勢明顯，而至第11 d 后基本穩(wěn)定；且隨著海藻酸鈉濃度的提高，浸出液OD 值變小，當(dāng)海藻酸鈉濃度達到25 mg·mL-1時，浸出液OD 值達到穩(wěn)定值，說明此濃度下，此時磁性攪拌珠穩(wěn)定性最佳。

圖3 海藻酸鈉濃度對磁性攪拌珠浸出液吸光度的影響Fig.3 Effects of sodium alginate concentrations on absorbance values of magnetic hydrogel beads leaching solutions

3.1.4 磁性攪拌珠力學(xué)性能

磁性攪拌珠的穩(wěn)定性也反映在其力學(xué)性能上。圖4為磁性攪拌珠應(yīng)力-應(yīng)變曲線和彈性模量。如圖4(a)所示，當(dāng)磁性攪拌珠壓縮程度達到80% 時，不同海藻酸鈉濃度的磁性攪拌珠的應(yīng)力-應(yīng)變曲線均未發(fā)生驟變現(xiàn)象，磁性攪拌珠均未破裂，表明其具有良好彈性。如圖4(b)所示，磁性攪拌珠的彈性模量隨海藻酸鈉質(zhì)量濃度的增加而增大；當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量濃度為25 mg·mL-1時，磁性攪拌珠的彈性模量為(17.22±1.09) kPa，與海藻酸鈉質(zhì)量濃度為30 mg·mL-1制備的磁性攪拌珠彈性模量(19.33±0.96) kPa 相近，而分別是另外兩組的2.71 和3.95 倍。在鈣離子濃度一定的條件下，海藻酸鈉濃度低時，與鈣離子結(jié)合不完全，所形成磁性攪拌珠強度小；海藻酸鈉質(zhì)量濃度達到25 mg·mL-1時，鈣離子與海藻酸鈉已經(jīng)充分結(jié)合形成致密的蛋殼結(jié)構(gòu)，且海藻酸鈉大分子之間相互作用[20]，增強磁性攪拌珠力學(xué)性能；繼續(xù)增大海藻酸鈉濃度，并不能夠繼續(xù)增大磁性攪拌珠的致密的空間結(jié)構(gòu)，因此對磁性攪拌珠的力學(xué)性能影響不大。

圖4 磁性攪拌珠機械性能Fig.4 Mechanical properties of magnetic hydrogel beads

可見，從溶脹率、浸泡液上清的濁度以及力學(xué)性能等指標(biāo)看，當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量濃度為25 mg·mL-1，所制備的雙組分磁性攪拌珠具有良好的穩(wěn)定性。

3.2 雙組分磁性攪拌珠在NK92 細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

利用雙組分磁性攪拌珠代替?zhèn)鹘y(tǒng)攪拌槳放入搖瓶(容積為100 mL)中，置于轉(zhuǎn)瓶機上組形成磁力攪拌瓶生物反應(yīng)器，用于NK-92 細胞的體外擴增。

NK-92 細胞以2×105cells·mL-1的密度接種于含有10 mL IMDM+10% FBS 的磁力攪拌瓶中，進行動態(tài)培養(yǎng)，并以T 25 培養(yǎng)瓶靜態(tài)培養(yǎng)為對照，以總細胞擴增倍數(shù)，擴增至8 d 后培養(yǎng)物中CD3-CD56+細胞的比例以及擴增后NK-92 細胞的殺傷活性為指標(biāo)，評估采用雙組分磁性攪拌珠動態(tài)培養(yǎng)對NK-92 細胞體外擴增的效果。

圖5 為培養(yǎng)8 d 時的細胞形態(tài)?？梢园l(fā)現(xiàn)，磁力攪拌瓶中NK-92 細胞大部分透亮，聚團較大；而T 25培養(yǎng)由瓶中細胞小而暗淡，細胞聚團較小，說明磁力攪拌瓶中NK-92 細胞狀態(tài)更好。磁性攪拌珠在轉(zhuǎn)動過程中將培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分均勻分散在培養(yǎng)體系中，同時分散細胞在生長過程中產(chǎn)生的代謝廢物，降低細胞周圍代謝廢物濃度，為細胞生長提供均一環(huán)境。此外磁性攪拌珠攪拌柔和，未打散細胞團，保障細胞間的相互作用[21]。

圖5 培養(yǎng)8 d 后NK-92 細胞的形態(tài)Fig.5 Morphology of NK-92 cells after 8 days

圖6 為NK-92 細胞的擴增效果。由圖6 可見，無論是靜態(tài)對照組還是磁力攪拌瓶中，細胞活性均能維持在90% 以上(圖6(a))。但磁力攪拌瓶中總細胞擴增倍數(shù)可達到(72.63±7.80)倍，顯著高于T 25 培養(yǎng)瓶中總細胞擴增倍數(shù)(22.4±1.46)倍(p＜0.05)(圖6(b))。此外，從圖6(c)可知，在整個擴增期間，磁力攪拌瓶中細胞的比生長速率μ均顯著高于T 25 方瓶(p＜0.05)。說明磁力攪拌瓶可用于NK-92 細胞的高效擴增。

培養(yǎng)8 d 后的培養(yǎng)物中CD3-CD56+細胞比例如圖7(a)所示。無論是磁力攪拌瓶還是T 25 培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)物中CD3-CD56+細胞的比例均在92%～96%，無顯著差別。進一步以K562 細胞作為靶細胞，評價擴增后NK-92 細胞的殺傷活性，結(jié)果如圖7(b)所示。當(dāng)效靶比為10:1 時，磁力攪拌瓶擴增后的細胞殺傷活性為(85.57±3.69)%，顯著高于T 25 培養(yǎng)瓶擴增后的細胞殺傷活性 (70.53±1.72)%(p＜0.05)?？梢?，利用磁力攪拌瓶擴增的NK-92 細胞具有更高的對K562 細胞的殺傷效應(yīng)。

圖7 NK92 細胞表型及功能(n=3)Fig.7 Phenotype and function of NK-92 cell (n=3)* compare with control, p＜0.05

4 結(jié) 論

本研究采用兩步法制備了具有良好穩(wěn)定性的海藻酸鈉/殼聚糖雙組分磁性攪拌珠。應(yīng)用該磁性攪拌珠配合搖瓶在轉(zhuǎn)瓶機上對NK-92 細胞進行動態(tài)培養(yǎng)時，總細胞擴增倍數(shù)可達到(72.63±7.80)倍，顯著高于T 25 培養(yǎng)瓶中的(22.41±1.46)倍(p＜0.05)；擴增后的細胞殺傷活性為(85.57±3.69)%，顯著高于T 25 培養(yǎng)瓶的(70.53±1.72)% (p＜0.05)。研究結(jié)果為免疫細胞體外擴增的生物反應(yīng)器研制以及培養(yǎng)方法的開發(fā)提供了新思路。