張蕾，馮曉俊，秦立婷，陳昭琳，唐麗琴，沈愛(ài)宗

中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)藥劑科，安徽省心血管病研究所，合肥 230001

《中國(guó)腦卒中防治報(bào)告2018》指出腦卒中是我國(guó)成年人致死、致殘的首位原因，其發(fā)病率及患病率整體呈上升趨勢(shì)。研究表明高同型半胱氨酸血癥增加腦卒中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，高血壓是腦卒中的重要危險(xiǎn)因素，且兩者在腦卒中發(fā)病中有協(xié)同作用[1]。針對(duì)我國(guó)高血壓患者中約有3/4患有高同型半胱氨酸血癥的現(xiàn)象，有學(xué)者提出將伴有高同型半胱氨酸血癥的原發(fā)性高血壓稱(chēng)為H型高血壓的概念[2]。因此對(duì)于伴高同型半胱氨酸(Hcy)的高血壓患者，需同時(shí)考慮血壓和血清Hcy水平。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是甲硫氨酸-葉酸代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，維持體內(nèi)正常的Hcy水平。本研究通過(guò)采用PCR-芯片法對(duì)高血壓患者的MTHFR C677T突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)及酶循環(huán)法測(cè)定血清Hcy水平，分析MTHFR基因多態(tài)性與H型高血壓及血清Hcy水平升高的相關(guān)性，為臨床診療提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年7月至2018年12月于中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院且數(shù)據(jù)資料較完整確診為腦卒中患者中的高血壓病患為研究對(duì)象。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均符合《中國(guó)高血壓防治指南(2018年修訂版)》制定的高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；高同型半胱氨酸血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)：血漿Hcy≥15 μmol/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：所有入組患者均排除繼發(fā)性高血壓；近期服用葉酸、維生素B12、維生素B6等影響血清Hcy水平藥物的患者；嚴(yán)重肝、腎、心功能不全者；合并惡性腫瘤者、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌疾病、精神疾病患者及妊娠或哺乳期婦女等人群；基本資料不全者。

1.3 儀器與試劑 主要儀器：SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)(蘇州凈化)；HFsafe-1200TE生物安全柜(上海力康)；NES-32核酸提取儀(杭州艾康)；HC-2518高速離心機(jī)(安徽中科中佳)；V2S025旋渦混合器(德國(guó)IKA)；m-microcentrifuge微量臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)Andybio)；CHB-T2金屬浴(杭州博日)；ScanDrop2超微量核酸蛋白測(cè)定儀(德國(guó)耶拿)；定性PCR儀(美國(guó)ABI2720)；BR-526-24全自動(dòng)雜交儀(上海百傲)；BE-3.0生物芯片識(shí)讀儀(上海百傲)；單道可調(diào)移液器(芬蘭百得)。主要試劑：全血基因組DNA提取試劑盒(磁珠法)；MTHFR(C677T)基因檢測(cè)試劑盒(PCR-芯片雜交法)；無(wú)水乙醇(化學(xué)純)；異丙醇(分析純)。

1.4 方法

1.4.1 一般資料的采集 通過(guò)檢索醫(yī)院病歷系統(tǒng)，詳細(xì)記錄患者的性別、年齡、身高、體質(zhì)量、血壓、吸煙史、飲酒史等基本資料；高血壓、糖尿病、高脂血癥、腦梗死等既往病史；家族遺傳史及用藥史?；颊叩难狧cy、葉酸(FA)、維生素B12(Vit B12)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、糖化血紅蛋白(HbA1c)等指標(biāo)。

1.4.2 MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)

1.4.2.1 血樣采集 靜脈取血1 mL，加至EDTA抗凝管中。

1.4.2.2 樣本DNA提取 按照杭州艾康公司生產(chǎn)的全血基因組DNA提取試劑盒(磁珠法)說(shuō)明書(shū)要求的流程操作，在96孔板的第1列及第7列中加入200 μL的待測(cè)樣本、400 μL的異丙醇和20 μL蛋白酶K。按照核酸提取儀操作規(guī)程設(shè)置程序進(jìn)行樣本DNA自動(dòng)提取。提取的DNA濃度采用ScanDrop2超微量核酸蛋白測(cè)定儀按照操作指南進(jìn)行檢測(cè)，濃度應(yīng)在10～60 ng/μL之間，A260/A280比值在1.5～2.0之間。

1.4.2.3 PCR擴(kuò)增 將分裝好的擴(kuò)增液，室溫解凍，低速離心，加入反應(yīng)液A 1 μL和DNA模板2 μL至液面下，瞬時(shí)離心混勻。運(yùn)行擴(kuò)增程序：50 ℃，5 min；94 ℃，5 min預(yù)變性；35個(gè)循環(huán)(94 ℃，25 s變性；56 ℃，25 s退火，72 ℃，25 s延伸)，72 ℃，5 min延伸。取出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2～8 ℃保存。

1.4.2.4 芯片雜交顯色 按照百傲免疫顯色試劑說(shuō)明書(shū)，吸取MTHFR反應(yīng)體系的擴(kuò)增產(chǎn)物20 μL加入180 μL雜交緩沖液，制成雜交反應(yīng)液。在已預(yù)裝洗液和預(yù)雜交液的8聯(lián)管，依次加入雜交反應(yīng)液、抗體及顯色液。在百傲全自動(dòng)雜交儀上按照說(shuō)明設(shè)置雜交程序，放入8聯(lián)管，運(yùn)行程序。反應(yīng)結(jié)束后，取出芯片。將芯片放入生物芯片識(shí)讀儀中，用百傲基因芯片圖片分析軟件(Baio Array Doctor)V3.0進(jìn)行圖像掃描判斷樣本的MTHFR基因型。

2 結(jié)果

2.1 MTHFR C677T等位基因及基因型分布頻率 對(duì)122例患者進(jìn)行MTHFR基因型檢測(cè)，結(jié)果輸出MTHFR三種基因型：677CC，677CT和677TT(見(jiàn)圖1)。將患者分為野生純合組(CC)32例，占比26.23%；雜合突變組(CT)53例，占比43.44%，純合突變組(TT)37例，占比30.33%；在研究人群中，男性患者基因型分布頻率為21.98% CC(20例)、43.96% CT(40例)、34.07% TT(31例)，等位基因頻率為43.96% C、56.04% T；女性患者CC、CT、TT基因型頻率為38.71% CC(12例)、41.94% CT(13例)、19.35% TT(6例)，等位基因頻率為59.68% C、40.32% T。MTHFR C677T多態(tài)性的基因型頻率分布在男性和女性患者相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但在男性、女性患者的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,男性患者等位基因T頻率高于女性(P<0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 MTHFR C677T基因型及芯片圖譜:A為CC型；B為CT型；C為T(mén)T型

表1 MTHFR C677T等位基因及基因型分布頻率[例(%)]

2.2 臨床基線資料 填寫(xiě)入選患者CRF表，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中男性91例，女性31例，患者年齡38～75歲，年齡(58.0±8.7)歲。3種基因型患者年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、收縮壓、平均舒張壓、吸煙飲酒史、既往病史等一般臨床資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，存在可比性(見(jiàn)表2)。其中37.7%的患者合并糖尿??；抽煙、飲酒多見(jiàn)于男性。

表2 三組基因型患者基礎(chǔ)特征比較

2.3 三組基因型患者生化資料比較 三組患者的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、TC、TG、HDL-C、LDL-C、BUN、Cr、UA、HbA1c比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

2.4 三組基因型患者Hcy、葉酸、維生素B12水平比較 在122例高血壓在患者中，純合型(TT)的Hcy水平[(19.47±11.84) μmol/L]高于雜合型(CT)[(14.21±9.55) μmol/L]高于野生型(CC)[(13.02±6.15)μmol/L]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。野生型的葉酸水平[(12.09±5.13)μg/L]高于雜合型[(10.52±4.97)μg/L]高于純合型[(7.17±3.16)μg/L]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。CC型的維生素B12水平[(409.25±221.05) pg/mL]高于CT型[(344.73±178.28) pg/mL]高于TT型[(268.54±101.80)pg/mL]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 三組基因型患者Hcy、葉酸、維生素B12水平比較

2.5 MTHFR C677T基因多態(tài)性與血清Hcy水平的關(guān)系 同型半胱氨酸檢測(cè)值正常者攜帶CC、CT、TT基因型頻率分別為32.88%、46.57%、20.55%；MTHFR在高同型半胱氨酸患者基因型頻率分別16.33%CC、38.77%CT、44.90%TT。高Hcy患者T等位基因頻率明顯高于正常Hcy患者，采用χ2檢驗(yàn)比較，等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明MTHFR C677T基因突變與Hcy升高存在一定的聯(lián)系，MTHFR C→T突變導(dǎo)致Hcy水平上升。見(jiàn)表4。

表4 MTHFR基因多態(tài)性與血清Hcy濃度的關(guān)系[例(%)]

3 討論

3.1 H型高血壓是腦卒中的主要危險(xiǎn)因素 我國(guó)腦卒中年齡標(biāo)準(zhǔn)化患病率、發(fā)病率和死亡率分別為1114.8/10萬(wàn)、246.8/10萬(wàn)和114.8/10萬(wàn)[4]，現(xiàn)狀不容樂(lè)觀?；谌珖?guó)性的高血壓調(diào)查顯示，我國(guó)18歲及以上人口中高血壓患病率有23%，患病人數(shù)約為2.445億，正常高值血壓的患病率為41.3%，患病人數(shù)約為4.353億[5]。

高同型半胱氨酸血癥和高血壓作為腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，對(duì)腦卒中的形成具有協(xié)同作用[6-9]。在我國(guó)75%的成年高血壓患者中伴有高同型半胱氨酸血癥(HHcy)。血清Hcy水平升高，腦卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加，而Hcy水平下降則能降低腦卒中風(fēng)險(xiǎn)。2017年的中國(guó)腦卒中一級(jí)預(yù)防研究(CSPPT)后續(xù)分析顯示，血清Hcy每下降20%，首發(fā)卒中的風(fēng)險(xiǎn)下降7%[10]。將伴有HHcy的高血壓稱(chēng)為H型高血壓。本研究共納入122例高血壓患者，H型高血壓占72%。其中男性H型高血壓的比例為78.02%，為71例，女性H型高血壓比例為54.84%，為17例，男性H型高血壓患病比例高于女性，可能與男性吸煙、飲酒率遠(yuǎn)高于女性有關(guān)。

3.2 MTHFR基因與同型半胱氨酸 高同型半胱氨酸水平與MTHFR基因突變有關(guān)[11-12]。吳子瑜等[13]研究表明純合型血漿Hcy濃度顯著高于雜合型和野生型(P值均<0.01)。本研究中MTHFR基因T等位基因的患者的Hcy水平遠(yuǎn)高于C等位基因患者，提示T等位基因與Hcy水平上升密切相關(guān)，與其他研究結(jié)果一致。

3.3 MTHFR C677T基因頻率分布 MTHFR基因C677T位點(diǎn)突變頻率在不同國(guó)家、不同地區(qū)及不同民族的分布有顯著差異。Shiao等[14]的關(guān)于MTHFR基因多態(tài)性突變的研究發(fā)現(xiàn)西班牙裔的純合突變頻率是20%，東亞為18.24%，中東為13.77%，混合人口為12.02%，白人11.13%，非洲2.52%以及南亞1.86%。一項(xiàng)針對(duì)中國(guó)多個(gè)省份MTHFR C677T 位點(diǎn)突變頻率的研究顯示，MTHFR 677TT基因型和677T等位基因在中國(guó)健康人群中的頻率分別為20%(18%～23%)和42%(38%～45%)[15]。本研究中男性患者基因型分布頻率為21.98% CC、43.96% CT、34.07% TT，女性患者CC、CT、TT基因型頻率為38.71% CC、41.94% CT、19.35% TT，同其他研究基因分布頻率大致相同。但男性T等位基因頻率與女性患者相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于納入樣本量過(guò)少導(dǎo)致。

3.4 MTHFR C677T基因多態(tài)性與H型高血壓的治療 本研究顯示TT基因型患者葉酸和維生素B12水平均低于CT基因型和CC基因型患者，這一關(guān)于葉酸濃度的結(jié)果與Tsang等[16]評(píng)估亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)677C>T多態(tài)性與血液葉酸濃度之間的關(guān)聯(lián)的分析結(jié)果一致，即CC>CT>TT。根據(jù)MTHFR基因多態(tài)性在臨床針對(duì)H型高血壓的治療，在控制血壓的同時(shí)補(bǔ)充葉酸很有必要。

本研究存在一定的局限性。本次實(shí)驗(yàn)樣本量相對(duì)較少，仍需進(jìn)行更大數(shù)據(jù)的臨床研究，結(jié)果更具有代表性；本次實(shí)驗(yàn)是回顧性實(shí)驗(yàn)，如果將實(shí)驗(yàn)設(shè)置為前瞻性研究，可以對(duì)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行更精確的設(shè)計(jì)，結(jié)果更有價(jià)值。

4 總結(jié)

H型高血壓是腦卒中的重要危險(xiǎn)因素，MTHFR C677T基因多態(tài)性是H型高血壓的重要遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素，且與Hcy、葉酸、維生素B12水平密切相關(guān)。對(duì)于高血壓患者，建議進(jìn)行MTHFR基因檢測(cè)，可以根據(jù)MTHFR基因分型，進(jìn)行危險(xiǎn)分層，個(gè)體化補(bǔ)充葉酸、維生素B12，有助于高血壓治療。隨著藥物基因組學(xué)的發(fā)展和精準(zhǔn)醫(yī)療的推進(jìn)，基因?qū)騻€(gè)體化治療的研究可以幫助合理用藥，減少不良反應(yīng)的發(fā)生，促進(jìn)精準(zhǔn)用藥。