徐子恒 ， 汪 敏 ， 王 粲 ， 周辰瑜 ， 楊耀炎 ， 韋 平

(廣西大學(xué)養(yǎng)禽與禽病研究所 ， 廣西 南寧 530000)

沙門菌(Salmonella)在自然界中分布廣泛，是一種重要的人獸共患病原菌，也是一種重要的食品源性病原菌，極易污染食品、水、畜禽動(dòng)物及其產(chǎn)品[1]，人或動(dòng)物一旦攝入了含有大量沙門菌的食物，可引發(fā)敗血癥、急性胃腸炎等中毒性疾病[2]。在我國(guó)，由沙門菌引起的食物中毒也是居細(xì)菌性食物中毒的首位[3]。沙門菌的致病機(jī)制多樣，致病性強(qiáng)弱與其毒力因子表達(dá)密切相關(guān)，而研究表明，沙門菌毒力相關(guān)基因主要分布于毒力島、菌毛、鞭毛、脂多糖和質(zhì)粒等[4]。所以明確攜帶毒力基因?qū)τ谏抽T菌感染后的治療至關(guān)重要。沙門菌不僅血清型復(fù)雜，目前已發(fā)現(xiàn)超過(guò)2 600種[1]，而且絕大多數(shù)血清型能在人和動(dòng)物間交叉?zhèn)魅?。吉韋沙門菌也是較流行的血清型之一，同時(shí)，吉韋沙門菌感染宿主非常廣泛，不僅可以感染人[5-7]，還可以感染動(dòng)物及動(dòng)物性肉品[8-9]，所以食品生產(chǎn)鏈的養(yǎng)殖、屠宰及銷售等任何一個(gè)環(huán)節(jié)被其污染，危害顯而易見[10]。目前，抗生素治療仍是防治沙門菌感染的主要方法，但隨著藥物選擇性壓力的加大，多重耐藥沙門菌亦隨之出現(xiàn)，而耐藥性可以沿著食品鏈傳播到環(huán)境或人[9,11]，成為公共健康的潛在威脅，從而更加難以防控。為了更好地控制沙門菌在整個(gè)食品鏈的源頭上污染，對(duì)養(yǎng)殖環(huán)節(jié)沙門菌開展流行病學(xué)調(diào)查和耐藥性分析，將對(duì)整個(gè)食品鏈防控沙門菌污染及人類生命安全具有重要意義。所以本試驗(yàn)開展種雞場(chǎng)不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)中吉韋沙門菌的分離鑒定、耐藥表型與毒力基因檢測(cè)及腸桿菌基因間重復(fù)共有序列的聚合酶鏈反應(yīng)(Enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction，ERIC-PCR)基因分型，為減少吉韋沙門菌在食品鏈源頭污染動(dòng)物性食品提供依據(jù)，對(duì)在食品鏈源頭上降低吉韋沙門菌對(duì)公共安全的潛在威脅有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 SC培養(yǎng)基、XLD培養(yǎng)基、沙門菌屬生化試劑盒，均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；沙門菌屬診斷血清(60種)、A～F多價(jià)血清，均購(gòu)自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司；GreenTaqMix、DL2 000 DNA marker，均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；藥敏紙片，購(gòu)自杭州微生物有限公司；引物合成及測(cè)序由北京六合華大基因有限公司完成；大腸桿菌質(zhì)控菌株(ATCC25922)由廣西壯族自治區(qū)疾病控制中心贈(zèng)予。PCR儀，美國(guó)Applied Biosystems公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)菌分離鑒定 無(wú)菌采集某種雞場(chǎng)不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)(種雞、種蛋、孵化后期死胚、1日齡殘次雞)的組織樣品265份，并參照實(shí)驗(yàn)室建立的方法[12-13]進(jìn)行細(xì)菌分離、PCR檢測(cè)、生化鑒定及血清學(xué)鑒定。

1.3 耐藥表型鑒定 采用Kirby-Bauer(K-B)藥敏紙片擴(kuò)散法對(duì)分離吉韋沙門菌進(jìn)行17種抗菌藥物的敏感性檢測(cè)[14]，同時(shí)以大腸桿菌ATCC25922為質(zhì)控菌株。

1.4 毒力基因檢測(cè) 參照本實(shí)驗(yàn)室前期建立的毒力基因(表1)的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)[1]。

表1 毒力基因及其引物序列Table 1 Virulence genes and their primer sequences

1.5 ERIC-PCR基因分型 ERIC-PCR反應(yīng)參照實(shí)驗(yàn)室前期方法進(jìn)行，獲得的ERIC-PCR指紋圖譜利用軟件Gel-Pro Analyzer 4.0和NTSYS-pc進(jìn)行遺傳關(guān)系聚類樹狀圖分析[12]。

2 結(jié)果

2.1 吉韋沙門菌的分離鑒定 經(jīng)細(xì)菌分離及PCR檢測(cè)(圖1)、生化鑒定(表2)血清分型公式為3,10∶l,v∶1,7，確定獲得8株吉韋沙門菌(3.02%，8/265)。其中在種雞場(chǎng)的孵化后期死胚中分離獲得5株， 在1日齡殘次雞的內(nèi)臟實(shí)質(zhì)器官中分離獲得3株。

圖1 分離菌invA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis image of invA gene PCR amplification products of isolatesM：DL2 000 plus marker； 1～8：分離菌；9：陽(yáng)性對(duì)照； 10：空白對(duì)照M:DL2 000 plus marker; 1- 8:Isolated bacteria; 9:Positive control; 10:Blank control

表2 分離菌生化反應(yīng)結(jié)果Table 2 Biochemical reaction results of isolates

2.2 耐藥表型的測(cè)定 如表3所示，8株吉韋沙門菌分離株均對(duì)SXT、TMP、SIZ及NAL表現(xiàn)耐藥，對(duì)CRO、CAZ、CIP、KAN、TET、NIT、FFC等抗菌藥表現(xiàn)敏感。絕大多數(shù)分離株對(duì)CTX、STR敏感性表現(xiàn)為中介。值得注意的是，所有分離株均表現(xiàn)多重耐藥(圖2)。

表3 吉韋沙門菌分離株對(duì)17種抗菌藥的敏感性測(cè)定結(jié)果Table 3 Sensitivity test results of S. give strains to 17 antibiotics

圖2 不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)吉韋沙門菌的ERIC基因分型、耐藥譜及毒力基因檢測(cè)情況Fig.2 ERIC genotyping,antimicrobial resistance profiles and virulence gene detection of S. give from different breeding stages注：*：孵化后期死胚和1日齡殘次雞Note：*：Dead embryos and 1 day-old defective chicks

2.3 毒力基因的檢測(cè) 結(jié)果如圖2所示，8株吉韋沙門菌分離株均攜帶stn、fimA、virK、invA、sseL、mgtC、siiE基因和sopB基因；其中1株從1日齡殘次雞中分離到的吉韋沙門菌(S-R37)攜帶毒力質(zhì)粒基因spvC。

2.4 菌株親緣關(guān)系分析 利用ERIC-PCR方法對(duì)8株 吉韋沙門菌分離株進(jìn)行基因分型，可分為5個(gè)ERIC型(ERIC-type，ET)(圖2)，遺傳相似性在14%～100%，結(jié)果顯示出良好的多態(tài)性并獲得了較好的指紋圖譜數(shù)據(jù)。

3 討論

本試驗(yàn)在孵化后期胚胎階段和出殼后1日齡階段均分離到吉韋沙門菌的污染；主要有以下2種可能：一是從孵化間的環(huán)境污染；二是種雞感染的垂直傳播。第1種情況為環(huán)境中污染，最好的措施就是對(duì)環(huán)境消毒，實(shí)施嚴(yán)格的生物安全措施；第2種情況，需要淘汰陽(yáng)性種雞以達(dá)到全群凈化的目的，但是這種副傷寒沙門菌目前并沒(méi)有好的檢測(cè)方法，凈化難度極大，這就對(duì)雞及其產(chǎn)品污染的風(fēng)險(xiǎn)增大，同時(shí)也會(huì)沿著食品鏈向屠宰、零售等環(huán)節(jié)傳播，甚至威脅到人的生命安全。所以利用基因分型對(duì)其污染溯源發(fā)現(xiàn)，8株分離株分別屬于5種不同的ERIC基因型，說(shuō)明分離株存在基因多樣性，其原因可能是與沙門菌的來(lái)源不同有關(guān)；另外，在孵化后期死胚(S-D25)和1日齡殘次雞(S-R29)中各有1株 吉韋沙門菌同屬1個(gè)ERIC基因型(ET-3)，說(shuō)明該公司吉韋沙門菌分離株有可能存在垂直傳播。

當(dāng)前，為了更好地防控吉韋沙門菌等副傷寒沙門菌的感染，優(yōu)先選擇的方法還是利用抗菌藥治療，但隨之而來(lái)的多重耐藥問(wèn)題更應(yīng)予以重視。有研究表明，馮彩峰等[15]在食品鏈養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的不同食品動(dòng)物(雞、豬、牛)上均分離到吉韋沙門菌，并且這些分離株對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素表現(xiàn)高耐藥率(97.30%)，表明養(yǎng)殖環(huán)節(jié)使用該類藥物頻率較高，應(yīng)該謹(jǐn)慎使用。而這也與本試驗(yàn)結(jié)果相似，8株吉韋沙門菌分離株對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素表現(xiàn)中度敏感，特別是頭孢噻肟(中介，87.5%)；另外，所有分離株對(duì)磺胺類和喹諾酮類(萘啶酸)均表現(xiàn)耐藥，且呈現(xiàn)多重耐藥，值得關(guān)注。

多重耐藥沙門菌除了因耐藥使得抗菌藥失效而帶來(lái)的危害，菌株本身所具有的毒力也是其危害之一。有研究表明，沙門菌的致病機(jī)制多樣，致病性強(qiáng)弱與其毒力因子表達(dá)密切相關(guān)[5]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所有的菌株均攜帶毒力島、菌毛與腸毒素基因，表明吉韋沙門菌分離株均具有強(qiáng)毒力的潛在威脅。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，沙門菌對(duì)昆明小鼠的致病性與毒力島基因sseL有密切關(guān)系[1]，而本試驗(yàn)中所有分離株均攜帶sseL基因，更加佐證了8株 吉韋沙門菌分離株均具有強(qiáng)致病性。另外，有1株從1日齡殘次雞中分離到的吉韋沙門菌攜帶毒力質(zhì)?；騭pvC，由于毒力質(zhì)粒具有傳播性，暗示應(yīng)對(duì)養(yǎng)殖環(huán)節(jié)防控吉韋沙門菌的感染提高警惕，降低吉韋沙門菌通過(guò)食品鏈傳播對(duì)人造成危害的風(fēng)險(xiǎn)。