王曉燕王捷

(1.廣西醫(yī)科大學 藥學院， 廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 藥學部， 廣西 南寧 530021)

0 引言

雙金花茶來源于中國廣西民間習用方，遵循中華醫(yī)藥傳統(tǒng)理論，結合壯醫(yī)通路排毒理論，精選金花茶葉、金銀花、菊花、玳玳花、茉莉花、槐花等配伍，經(jīng)現(xiàn)代先進工藝制備的復方中藥制劑，有清熱解毒、平肝明目、活血理氣、利濕消腫、退黃止痢功效，主治風熱頭痛、目赤腫痛、黃疸、痢疾等。金花茶葉，收載于廣西壯族自治區(qū)壯藥質量標準(第二卷)，味微苦、澀,性平，歸肝、腎經(jīng)，清熱解毒、利尿消腫、止痢，用于咽喉疼痛、臌脹、水腫、小便不利、瘡瘍、泄瀉、痢疾等?，F(xiàn)代藥理學發(fā)現(xiàn)金花茶葉抗氧化、抑菌、降血脂、降血糖等[1- 4]。金銀花，味甘、性寒，歸肺、胃經(jīng)，清熱解毒，主溫病發(fā)熱、熱毒血痢、癰腫疔瘡、喉痹等。金銀花有顯著抗菌消炎作用，現(xiàn)代譽為“植物抗生素”[5]。菊花，味苦、甘，性微寒，歸肺、肝經(jīng)，散風清熱、平肝明目、清熱解毒，主治風熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、眼目昏花、瘡癰腫毒。玳玳花，味辛甘，微苦，性平，理氣寬胸、和胃止嘔，主胸中痞悶、脘腹脹痛、不思飲食、惡心嘔吐。茉莉花，味辛、甘，性溫，理氣、開郁、辟穢、和中，用于下痢腹痛、目赤紅腫、瘡毒。 現(xiàn)代藥理學發(fā)現(xiàn)其提高免疫力、抗氧化、抗菌等[6]。槐花，味苦、性微寒，歸肝、大腸經(jīng)，入血斂降、涼血止血、清肝瀉火，主治腸風便血、尿血、衄血、肝火頭痛、目赤腫痛、癰疽瘡瘍等。該方諸藥合用，發(fā)揮協(xié)同增效作用?，F(xiàn)在已有基礎上，觀察雙金花茶對重要器官肝臟的影響，采用皮下注射CCl4，造成小鼠急性肝損傷，探討雙金花茶對肝損傷的保護作用及可能的機制，為深入研究雙金花茶的保肝作用及后續(xù)開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

KM小鼠50只，SPF級，雄性，體重為18.0～22.0 g。由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，適應性飼養(yǎng)3 d后，隨機分組進行藥物處理。動物生產(chǎn)許可證：SCXK桂2014—0002，使用許可證：SYXK桂2014—0003。

1.2 試藥

雙金花茶(由項目課題組自制，批號20181019)； ALT(批號20181027);AST(批號20181017);MDA(批號20181101);SOD(批號20181030)及GSH-Px(批號20181029)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度劑盒購于碧云天生物技術研究所。

1.3 儀器

S10手提式高速分散器(寧波新芝生物公司);MICRO17R高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技有限公司);XS205DU電子分析天平(梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司);CX31DP73生物顯微鏡(奧林巴斯(中國)有限公司);TV-1901紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);SpectraMaxPlus384連續(xù)光譜掃描式酶標儀(香港分子儀器公司)。

2 方法

2.1 分組及給藥

將50只雄性昆明種小鼠隨機分成5組，分別為空白對照組、溶媒對照組、模型組及雙金花茶低、高劑量組(2.59、10.35 g/kg)，每組10只[7]。雙金花茶組按小鼠體重20 mL/kg進行灌胃，每天1次，連續(xù)14 d?？瞻讓φ战M、溶媒對照組和模型組以同樣方式給予蒸餾水灌胃。末次給藥后，模型組和雙金花茶組小鼠給予25%CCl4油溶液皮下注射10 mL/kg造成急性肝損傷，溶媒組以同樣方式皮下注射等量的花生油。24 h后摘除眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠，取其肝臟和脾臟。

2.2 血清 ALT、AST 水平的測定

摘除眼球后，分離血清，以ALT、AST水平作為急性肝損傷的生化指標。將血液盛入離心管中，靜置10 min，低溫離心，取上層血清。按照試劑盒說明方法測定小鼠血清中ALT、AST的含量。

2.3 肝組織 MDA、SOD 及 GSH-Px 水平的測定

采血結束后，處死小鼠，分離肝臟，制備10%的肝組織勻漿。按照試劑盒說明方法用紫外可見分光光度計測定肝勻漿中MDA、SOD、GSH-Px的含量[8]。

2.4 臟器指數(shù)計算

摘取小鼠的肝臟和脾臟，肉眼觀察小鼠肝臟和脾臟的外觀，立即放入生理鹽水中漂洗干凈后吸干血水，分別對肝、脾進行稱量，計算臟器指數(shù)(臟器指數(shù)=臟器質量/體重×100%)[9]。

2.5 HE染色觀察肝組織病理變化

取小鼠肝右葉組織切成塊狀，保存在4%多聚甲醛磷酸緩沖溶液中，嵌入石蠟，制成石蠟切片,常規(guī)HE 染色，光學顯微鏡下組織的病理變化[10]。

2.6 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 雙金花茶對小鼠血清ALT、AST水平的影響

雙金花對CCl4所致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST水平的影響見表1。從表1結果顯示，與空白對照組和溶媒對照組比較，單次給藥25%CCl4可使模型組小鼠血清ALT、AST水平顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，所有劑量組經(jīng)過雙金花茶預處理14 d后，血清ALT和AST水平明顯降低。雙金花茶低劑量組(2.59 g/kg)可阻止小鼠CCl4引起的血清ALT、AST升高，但差別不具統(tǒng)計學差異，高劑量組(10.35 g/kg)可顯著降低ALT和AST水平(P<0.01)。

表1 雙金花茶對CCl4所致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST水平的影響Tab.1 Effects of Shuangjinhua tea on the serum levels of ALT and AST in mice with acute liver injury induced by CCl4

3.2 雙金花茶對小鼠肝組織 MDA、SOD、GSH-Px水平的影響

雙金花茶對CCl4所致急性肝損傷小鼠肝勻漿 MDA、SOD、GSH-Px水平的影響見表2。從表2結果顯示，模型組MDA相較于空白對照組顯著提升(P<0.01)，SOD、GSH-Px活性顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，雙金花茶顯著降低肝臟MDA水平(P<0.05，P<0.01)，可減輕肝細胞損傷的嚴重程度。高劑量組SOD、GSH-Px活性顯著升高(P<0.01)，低劑量組小鼠SOD、GSH-Px活性具有升高趨勢，但不具統(tǒng)計學差異，說明雙金花茶在一定程度上可恢復肝臟抗氧化酶的活性。

表2 雙金花茶對CCl4所致急性肝損傷小鼠肝勻漿 MDA、SOD、GSH-Px水平的影響Tab.2 Effects of Shuangjinhua tea on the levels of MDA,SOD and GSH-Px in liver homogenates of CCl4-treated mice

3.3 雙金花茶對肝脾指數(shù)的影響

雙金花茶對CCl4致急性肝損傷小鼠肝脾指數(shù)的影響見表3。從表3結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠肝臟、脾臟明顯腫大，肝脾指數(shù)均顯著增加(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，雙金花茶肝指數(shù)有不同程度降低，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，低劑量組小鼠脾指數(shù)降低不具統(tǒng)計學差異，高劑量組脾指數(shù)顯著減少(P<0.05),表明雙金花茶對急性肝損傷所造成的肝脾腫大具有抑制作用。

表3 雙金花茶對CCl4致急性肝損傷小鼠肝脾指數(shù)的影響Tab.3 Effect of Shuangjinhua tea on index of liver and spleen of mice with CCl4-induced acute liver injury

3.4 雙金花茶對肝組織結構的影響

雙金花茶對小鼠肝組織病理學的影響如圖1所示。根據(jù)圖1肝組織切片顯示，對照組肝組織病理顯示肝細胞正常；與對照組比較，單次給藥25%CCl4可導致模型組小鼠肝臟結構喪失，包括空泡形成、炎性浸潤和壞死；雙金花茶低、高劑量與模型組比較，肝細胞空泡、腫脹明顯改善，肝組織炎癥反應均有不同程度的減輕，病變程度相對較低。

(a) 空白對照組

(b) 溶媒對照組

(c) 模型組

(d) 雙金花茶低劑量組

(e) 雙金花茶高劑量組

4 討論

皮下注射CCl4是構建小鼠急性肝損傷模型的較為便捷的方法。當肝細胞受到CCl4破壞時，代謝過程中會產(chǎn)生大量高反應性的自由基，細胞膜脂質過氧化，引起膜通透性增加，從而誘發(fā)肝損傷。由于質膜破損而使一些肝細胞內(nèi)的酶逸出細胞外，這些酶在血清中濃度驟然升高，其中ALT、AST能敏感地反映肝細胞損與否及損傷程度[11]。在皮下注射CCl424 h后，急性肝損傷模型得以確立，CCl4導致了小鼠的ALT和AST血清水平顯著增加，肝臟和脾臟組織腫大并伴有組織病理學病變，例如肝細胞空泡變性，小葉間靜脈被大量的炎性細胞浸潤。雙金花茶含有黃酮、多酚、多糖等活性成分，可抑制和阻止氧自由基反應，同時提高體內(nèi)抗氧化酶的活性。通過雙金花茶預處理14 d，抗自由基活性成分發(fā)揮作用，較好地保護機體組織不受CCl4造成的氧化侵襲，可以改善ALT和AST血清水平，緩解小鼠肝脾腫脹，對CCl4引起的小鼠肝細胞炎癥和壞死具有保護作用。

CCl4誘導肝損傷時，脂質在過氧化過程中會產(chǎn)生脂質過氧化產(chǎn)物MDA，能引起肝細胞膜蛋白變性，增加細胞膜的通透性，反映了肝細胞損傷的嚴重程度。SOD、GSH-Px能清除氧源性自由基及前體自由基即活性氧，而減輕活性氧引起的損傷。活性氧生成過多，抗氧化系統(tǒng)失去平衡，SOD、GSH-Px可以阻止細胞膜結構遭到活性氧的破壞，一旦兩者的活性受到了抑制，引起肝細胞損傷加劇。因此，可通過檢測肝臟SOD和GSH-Px的水平，反映機體過氧化過程中清除氧自由基的能力。本實驗研究證明，CCl4導致肝組織MDA水平顯著增加，SOD和GSH-Px水平顯著下降，表明肝細胞受到過氧化損傷。雙金花茶中內(nèi)含豐富的抗氧化活性成分，具有抗氧化作用和抗炎作用，保護細胞免受氧化應激。通過抑制脂質過氧化反應從而對肝臟產(chǎn)生保護作用，使MDA水平均明顯降低，并進一步提高SOD、GSH-Px水平，增強肝細胞的抗氧化和清除氧自由基能力，減輕肝損傷程度。

綜上所述，本文的研究結果初步證明了雙金花茶對CCl4誘導小鼠的急性肝損傷具有有效的預防與保護作用，其作用機制可能是通過抑制細胞膜脂質過氧化和清除活性氧自由基、增強其抗氧化作用，從而預防和阻止肝損傷，其藥理作用的具體分子機制仍需進一步深入研究。雙金花茶對CCl4誘導的肝損傷具有顯著的抗氧化和護肝活性，可開發(fā)為相應的護肝保健品。