王博文， 曾曉華， 彭凱歌， 劉 暢， 武瑩超， 黃英眉，馬盼盼， 拉姆次仁， 李國(guó)凱，楊 莉

（1.西藏軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心，西藏 拉薩 850000；2.西藏軍區(qū)總醫(yī)院感染科，西藏 拉薩 850000）

呼吸道感染是臨床最常見(jiàn)的感染性疾病之一，發(fā)病率和病死率常年居高不下[1]。西藏地區(qū)海拔高、氣壓低、氧氣稀薄、氣溫變化快，極易引起機(jī)體免疫力下降，呼吸道感染的發(fā)病率更高，患者病情更重、病程更長(zhǎng)[2]。目前，臨床上普遍采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR）檢測(cè)患者鼻拭子和咽拭子樣本中的呼吸道病原體，該方法具有通量高，敏感性和特異性好的特點(diǎn)，對(duì)呼吸道感染的病原學(xué)診斷具有重要意義[3]。

2019年年底以來(lái)，由于嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiatory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）檢測(cè)生物安全防護(hù)的需要，鼻拭子和咽拭子樣本在進(jìn)行核酸檢測(cè)前需要56 ℃熱處理30 min，以達(dá)到病毒滅活的目的[4-5]。但在實(shí)際操作過(guò)程中，受檢測(cè)單位條件和檢測(cè)人員操作的限制，滅活溫度會(huì)有所波動(dòng)，滅活時(shí)間也時(shí)常延長(zhǎng)。不同滅活條件對(duì)樣本呼吸道病原體核酸檢測(cè)結(jié)果是否會(huì)產(chǎn)生影響，目前鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究收集了12例腺病毒、支原體、甲型流感病毒或乙型流感病毒檢測(cè)陽(yáng)性患者的鼻拭子和咽拭子樣本，設(shè)計(jì)不同的滅活條件，對(duì)比滅活前后qPCR的檢測(cè)結(jié)果，為確保呼吸道病原核酸檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2020年1月—2021年3月就診于西藏軍區(qū)總醫(yī)院腺病毒、支原體、甲型流感病毒或乙型流感病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性患者的鼻拭子和咽拭子樣本各3份，共計(jì)12份。

1.2 儀器與試劑

TaKaRaMiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司]，腺病毒、支原體、甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒（北京金豪制藥股份有限公司），病毒采樣管（北京友康生物公司），Rotor Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（德國(guó)Qiagen公司），恒溫水槽（常州澳華儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 （1）咽拭子樣本。用聚丙烯纖維頭塑料桿拭子擦拭患者雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，然后將拭子頭浸入病毒采樣管的采樣液中，尾部棄去，旋緊采樣管螺旋口。（2）鼻拭子樣本。將聚丙烯纖維頭塑料桿拭子輕輕插入患者鼻道內(nèi)鼻腭處，停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)退出，然后將拭子頭浸入同一病毒采樣管的采樣液中，棄去尾部，旋緊采樣管螺旋口。

1.3.2 樣本滅活溫度梯度和時(shí)間梯度設(shè)置 將鼻拭子和咽拭子樣本置于恒溫水槽中，分別于56、66、76和86 ℃熱處理30 min；于56 ℃分別處理30、60、120、240、480和960 min。處理完畢后進(jìn)行樣本核酸提取。

1.3.3 核酸提取和病原體檢測(cè) 采用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit提取核酸，按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，每個(gè)樣本提取需要200 μL采樣液。采用腺病毒、支原體、甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒在Rotor Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行qPCR檢測(cè)，按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，陽(yáng)性判讀標(biāo)準(zhǔn)參考各試劑盒說(shuō)明書(shū)，所有檢測(cè)均重復(fù)3次，取平均循環(huán)閾值（cycling threshold，Ct）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每組樣本的Ct值用±s表示。未滅活和不同滅活條件處理樣本之間Ct值的比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本信息

患者的性別、年齡、病原學(xué)診斷、核酸類型和Ct值見(jiàn)表1。

表1 患者基本信息

2.2 不同滅活溫度對(duì)樣本qPCR檢測(cè)結(jié)果的影響

對(duì)于腺病毒和支原體，56 ℃和66 ℃滅活3 0 m i n 與未滅活相比，C t 值無(wú)明顯變化（P＞0.05），76 ℃和86 ℃滅活30 min可引起樣本Ct值顯著升高（P＜0.05、P＜0.01）；甲型流感病毒和乙型流感病毒，56 ℃滅活30 min與未滅活相比，Ct值無(wú)明顯改變（P＞0.05），66 ℃、76 ℃和86 ℃滅活30 min會(huì)導(dǎo)致樣本Ct值升高（P＜0.05、P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 不同滅活溫度對(duì)樣本qPCR檢測(cè)結(jié)果的影響

2.3 不同滅活時(shí)間對(duì)樣本qPCR檢測(cè)結(jié)果的影響

對(duì)于腺病毒和支原體，56 ℃滅活30、60、120和240 min與未滅活相比，Ct值無(wú)明顯變化（P＞0.05）；滅活480和960 min可引起樣本Ct值顯著上升（P＜0.01、P＜0.001）。對(duì)于甲型流感病毒和乙型流感病毒，56 ℃滅活30、60和120 min與未滅活相比，Ct值無(wú)明顯改變（P＞0.05）；滅活240、480和960 min會(huì)導(dǎo)致樣本Ct值增大（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）。見(jiàn)圖2。

圖2 不同滅活時(shí)間對(duì)樣本qPCR檢測(cè)結(jié)果的影響

3 討論

西藏自治區(qū)平均海拔超過(guò)4 000 m，年平均氣溫8 ℃，氧含量低，對(duì)人體免疫系統(tǒng)損傷大，極易引起呼吸道感染[6-7]。80%以上的高原呼吸道疾病是由非細(xì)菌性病原體引起的，其中腺病毒、肺炎支原體、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒最為常見(jiàn)[8]。qPCR檢測(cè)已成為呼吸道病原學(xué)診斷的主流方法，該方法簡(jiǎn)便易行、靈敏度高、特異性強(qiáng)。隨著新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）疫情的出現(xiàn)，為了最大程度保護(hù)實(shí)驗(yàn)室人員，COVID-19診療方案明確指出，SARS-CoV-2樣本檢測(cè)前一定要經(jīng)過(guò)滅活處理，推薦滅活方式為56 ℃熱處理30 min[9]。然而不同的病原體對(duì)熱滅活的敏感性相差很大：對(duì)于嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒，56 ℃熱處理30 min可以使其核酸降解，并低于檢測(cè)限[10]；而SARS-CoV-2 56 ℃熱處理30 min只能將病毒滅活，不會(huì)影響核酸檢測(cè)結(jié)果[11]；同樣，該滅活操作將會(huì)導(dǎo)致豬流行性腹瀉病毒——冠狀病毒RNA的明顯降解[12]。但是目前尚未見(jiàn)熱滅活處理對(duì)常見(jiàn)呼吸道病原體檢測(cè)結(jié)果的影響的相關(guān)研究。此外，西藏自治區(qū)檢測(cè)單位條件相對(duì)落后，一些實(shí)驗(yàn)室樣本加熱設(shè)備溫控系統(tǒng)不穩(wěn)定，實(shí)際溫度可能比預(yù)設(shè)溫度高幾十度；一些實(shí)驗(yàn)人員操作不規(guī)范，隨意延長(zhǎng)樣本滅活時(shí)間，甚至過(guò)夜滅活。這些問(wèn)題都可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成巨大影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，DNA病原體和RNA病原體對(duì)熱的敏感性不盡相同，相同滅活時(shí)長(zhǎng)，腺病毒和支原體核酸可以抵御66 ℃熱滅活，而甲型流感病毒和乙型流感病毒在66 ℃就會(huì)出現(xiàn)不同程度的核酸降解；同樣的滅活溫度下，腺病毒和支原體核酸可以承受240 min加熱，而甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸只能在120 min內(nèi)維持穩(wěn)定；這可能是不同核酸類型結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性不同決定的[13]。尤其是對(duì)于核酸含量較低的弱陽(yáng)性樣本，提高滅活溫度和延長(zhǎng)滅活時(shí)間可能會(huì)造成樣本Ct值的明顯變化，甚至可能導(dǎo)致樣本核酸檢測(cè)假陽(yáng)性結(jié)果。本研究未收集到病毒載量很低的弱陽(yáng)性樣本，沒(méi)有展示出滅活條件改變對(duì)弱陽(yáng)性樣本檢測(cè)結(jié)果的影響，我們會(huì)在下一步研究中進(jìn)行深入探討。

綜上所述，為保證qPCR檢測(cè)的敏感性，避免呼吸道病原體的漏檢、誤檢，建議對(duì)于鼻拭子和咽拭子樣本進(jìn)行滅活處理時(shí)，溫度應(yīng)控制在56 ℃左右，滅活時(shí)間應(yīng)控制在120 min以內(nèi)。各臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)結(jié)合自身實(shí)際情況，盡可能優(yōu)化操作步驟，嚴(yán)格操作流程，確保檢測(cè)過(guò)程安全、規(guī)范，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、可靠。