張瀟月,溫朝平,周 宇,董凱密,陳 華,王仁睿,侯大斌,楊玉霞,余 馬
(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川 綿陽(yáng) 621010;2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥材品質(zhì)及創(chuàng)新中藥研究四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610041)
青牛膽(Tinospora sagittata)為防己科青牛膽屬草質(zhì)藤本植物,主要分布于湖北西部和西南部、陜西南部、四川東部至西南部、西藏東南部、湖南、江西等地[1],其塊根名為金果欖,是常用中藥,含有生物堿、萜類、甾醇類等活性成分[2],主要用于治療咽喉腫痛、癰疽疔毒、痢疾等疾?。?]。由于國(guó)家對(duì)中醫(yī)藥行業(yè)的大力支持,市場(chǎng)對(duì)金果欖的需求量急劇增加,使得青牛膽野生資源被無(wú)序采挖,趨于短缺。為了解決這一問(wèn)題,人工栽培青牛膽是實(shí)現(xiàn)該藥材可持續(xù)發(fā)展的重要途徑。
組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖系數(shù)高、品種遺傳穩(wěn)定性高、不受季節(jié)和自然條件限制等優(yōu)點(diǎn),可實(shí)現(xiàn)種苗的大批量生產(chǎn)[4]。目前針對(duì)青牛膽的組織培養(yǎng)報(bào)道較少,劉艷等[5]建立了青牛膽的組培快繁體系,確定了消毒時(shí)間、嫩莖和嫩葉愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基、腋芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。本課題組以劉艷等[5]報(bào)道的快繁體系為參考,建立青牛膽的組織快繁體系,前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)莖段不同節(jié)間的出芽率存在較大差異,且在繼代培養(yǎng)時(shí)存在叢生芽長(zhǎng)勢(shì)較弱、葉色較淺的情況。因此,本研究以青牛膽莖段為材料,篩選腋芽最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基,研究不同節(jié)間對(duì)腋芽誘導(dǎo)的影響及不同培養(yǎng)基對(duì)壯苗的作用,以期為青牛膽的規(guī)?;a(chǎn)提供技術(shù)支持,對(duì)青牛膽優(yōu)質(zhì)種苗的工廠化生產(chǎn)具有重要的實(shí)踐意義。
青牛膽采自四川峨眉山,引種于西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院龍山實(shí)驗(yàn)基地溫室中栽培,選取青牛膽生長(zhǎng)狀態(tài)一致的莖段為材料。
1.2.1 外植體消毒 將青牛膽枝條根據(jù)莖節(jié)所在部位不同進(jìn)行編號(hào),頂端的莖段標(biāo)記為①號(hào),以下的帶芽莖節(jié)依次標(biāo)記為②~⑥(圖1a)。將莖段分別剪成1.0~1.5 cm長(zhǎng)帶1個(gè)節(jié)的莖段(圖1b),按照不同編號(hào)進(jìn)行收集。去除葉片,用飽和洗衣粉溶液浸泡10min,流水沖凈,75%乙醇浸泡30 s,無(wú)菌水沖洗2次,0.1%升汞溶液+1~2滴吐溫-20振蕩消毒7 min,無(wú)菌水沖洗4次,無(wú)菌濾紙吸干多余的水分備用。
1.2.2 莖段不同節(jié)間的腋芽誘導(dǎo) 切去莖段兩端與升汞溶液接觸的部分,將莖段依次接種于MS+0.2mg/L 6-BA+0.5 mg/LKT+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L GA3啟動(dòng)培養(yǎng)基[5]培養(yǎng)4周。培養(yǎng)基中添加蔗糖30 g/L,瓊脂7 g/L,pH為5.8,培養(yǎng)溫度為(24±2)℃,光照強(qiáng)度為1 800 lx,光照時(shí)間為12 h/d。
1.2.3 增殖培養(yǎng) 將誘導(dǎo)出的腋芽(>0.5 cm)切下,接種于新鮮的MS+0.2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.2mg/L NAA+0.5 mg/L GA3培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)4周,培養(yǎng)環(huán)境同上。
1.2.4 壯苗試驗(yàn) 將增殖后較弱的叢生芽分成單株,挑選高度一致的苗接種于MS和MS+10 mL/L乙二胺四乙酸鐵鈉(EDTA-Fe)2種培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗培養(yǎng)4周,培養(yǎng)環(huán)境同上。
1.2.5 生根培養(yǎng) 將壯苗后的植株轉(zhuǎn)至1/2 MS+0.5mg/L IBA+0.5 mg/L NAA[5]進(jìn)行生根培養(yǎng)6周,培養(yǎng)環(huán)境同上。
1.2.6 移栽煉苗 待生根完成后,逐漸打開(kāi)瓶口,使生根苗逐漸適應(yīng)外界環(huán)境,煉苗1周后,取出小苗,洗凈根部的培養(yǎng)基,用0.5%多菌靈溶液浸泡小苗根部10 min,清洗晾干后,移至滅過(guò)菌的珍珠巖+園土(1∶1)基質(zhì)中培養(yǎng),相對(duì)濕度70%~80%,加強(qiáng)通風(fēng),1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)成活率。
每個(gè)處理接種10個(gè)外植體,重復(fù)3次,莖段不同節(jié)間的腋芽誘導(dǎo)試驗(yàn)于培養(yǎng)4周時(shí)統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率和>0.5 cm的腋芽數(shù)量,壯苗試驗(yàn)培養(yǎng)4周時(shí)統(tǒng)計(jì)平均株高和葉色情況。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行顯著性分析。
誘導(dǎo)率=(萌芽的外植體數(shù)量/接種外植體總數(shù))×100%。
褐化率=(褐化的外植體數(shù)量/接種外植體總數(shù))×100%。
在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后可觀察到腋芽開(kāi)始萌動(dòng)(圖1c),培養(yǎng)4周后莖段不同節(jié)間在同一種誘導(dǎo)培養(yǎng)基上對(duì)腋芽的誘導(dǎo)情況存在很大差異,隨著①號(hào)莖節(jié)至⑦號(hào)莖節(jié)位置的變化,腋芽的誘導(dǎo)率和>0.5 cm的腋芽數(shù)量逐漸降低,褐化率逐漸增高。①號(hào)莖節(jié)的誘導(dǎo)率為93.3%,顯著高于其他部位,褐化率為13.3%,>0.5 cm的腋芽數(shù)量為6.7個(gè),除了與②號(hào)莖節(jié)的褐化率和腋芽數(shù)量差異不顯著外,顯著優(yōu)于其他部位。⑥和⑦號(hào)莖節(jié)的誘導(dǎo)率分別為26.7%和20.0%,顯著低于其他部位,褐化率達(dá)50.0%、63.3%,>0.5 cm的腋芽數(shù)量分別為2.3、2.0個(gè)(表1)。
表1 不同莖節(jié)對(duì)腋芽的影響
鐵鹽對(duì)青牛膽組培苗的壯苗效果起著關(guān)鍵作用,在壯苗培養(yǎng)基里生長(zhǎng)4周后,生長(zhǎng)在MS+10 mL/L EDTA培養(yǎng)基的組培苗平均苗高為4.1 cm(圖2),平均葉片數(shù)量為6.5片,葉色濃綠(圖1d)。生長(zhǎng)在MS培養(yǎng)基的組培苗平均苗高和平均葉片數(shù)量均顯著低于前者,分別為2.8 cm和3.3片,葉色較淡(圖1d)。
圖2 不同壯苗培養(yǎng)基對(duì)平均苗高和葉片數(shù)量的影響
目前青牛膽的組織培養(yǎng)相關(guān)研究很少,已報(bào)道的青牛膽[5]和青牛膽屬部分植物如寬筋藤[6]、心葉青牛膽[7]建立的快繁體系并未研究不同莖節(jié)對(duì)腋芽誘導(dǎo)的影響。本研究在劉艷等[5]建立的組培快繁體系基礎(chǔ)上,著重研究不同莖節(jié)對(duì)腋芽誘導(dǎo)的差異,并證明培養(yǎng)基中添加10 mL/L的EDTA-Fe是有效的壯苗方式,解決了青牛膽增殖叢生芽孱弱的問(wèn)題,有效地提高了種苗的質(zhì)量。①號(hào)莖節(jié)的誘導(dǎo)率和>0.5 cm的腋芽數(shù)量分別達(dá)93.3%和6.7個(gè),顯著高于其他莖節(jié),隨著莖節(jié)位置的變化,誘導(dǎo)率和>0.5 cm腋芽數(shù)量顯著降低,褐化率升高,證明莖節(jié)的幼嫩程度對(duì)腋芽誘導(dǎo)的影響較大,木質(zhì)化程度越高的莖節(jié)越容易褐化。在實(shí)際生產(chǎn)中,為了增大外植體的數(shù)量,并保證較高的誘導(dǎo)率,可以使用①~⑤號(hào)莖節(jié)作為外植體,平均誘導(dǎo)率為67.3%,平均褐化率為32.7%,>0.5 cm的平均腋芽數(shù)量為4.5個(gè)。⑥、⑦號(hào)莖節(jié)木質(zhì)化程度高,平均誘導(dǎo)率為23.4%,平均褐化率達(dá)56.7%,不適合選作外植體。
莖節(jié)作為外植體進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)已在多種藥用植物上有所應(yīng)用,如燈油藤(Celastrus paniculatus)[8]、白花莧(Aerva sanguinolenta)[9]、穿心蓮(Andrographis paniculata)[10]、短蕊萬(wàn)壽竹(Disporum cantoniense)[11]、公石松[12]等。據(jù)研究,不同位置的莖節(jié)對(duì)腋芽誘導(dǎo)的效率不同。Gitonga等[13]報(bào)道澳洲堅(jiān)果靠近頂端的1~3號(hào)莖節(jié)對(duì)腋芽的誘導(dǎo)效果優(yōu)于靠近基部的4~6節(jié);Shirdel等[14]報(bào)道玫瑰基部莖節(jié)的腋芽萌發(fā)率最高,為30%,腋芽長(zhǎng)度為5.75 cm,中間莖節(jié)的腋芽萌發(fā)率最低,為17.4%,腋芽長(zhǎng)度為2.8 cm。以上研究說(shuō)明不同植物不同位置的莖節(jié)對(duì)腋芽的誘導(dǎo)情況不同。劉艷等[5]報(bào)道的青牛膽腋芽誘導(dǎo)率為45%,應(yīng)是多個(gè)位置的節(jié)間混合而得的平均誘導(dǎo)率。本研究結(jié)果表明,①號(hào)莖節(jié)腋芽誘導(dǎo)率最高,隨著位置向下變化,腋芽誘導(dǎo)率逐漸降低,由此可見(jiàn),篩選節(jié)間位置可有目的地進(jìn)行取樣,并有效提高腋芽誘導(dǎo)率。
褐化容易造成植物死亡,是組織培養(yǎng)過(guò)程中一個(gè)重要的問(wèn)題,這主要與植物體酚類化合物的含量有關(guān),當(dāng)植物體表面形成傷口,酚類化合物氧化,形成黑色或褐色螯合物,導(dǎo)致植物部分變暗[15,16]。不同位置的莖節(jié)在組織培養(yǎng)過(guò)程中褐化程度不同,這是因?yàn)槎喾宇惢衔镌谀举|(zhì)化程度高的組織中合成較多,在木質(zhì)化程度低的幼嫩組織中合成較少[17]。石榴頂端莖節(jié)(1.5 cm)在組培過(guò)程中褐化程度最輕,基部莖節(jié)褐化程度最重[18],這與本研究結(jié)果一致,青牛膽①、②號(hào)莖節(jié)的褐化率為20%以下,③~⑦號(hào)莖節(jié)的褐化率增至40%以上。由此可見(jiàn),在外植體的選擇上,選擇幼嫩、褐化程度較輕的莖節(jié)可極大地降低褐化率,提高成活率。
植物種苗經(jīng)增殖階段后,容易出現(xiàn)叢生芽孱弱的現(xiàn)象,影響生根和后期移栽效果,為了使種苗健壯,需要在增殖之后進(jìn)行壯苗培養(yǎng)。據(jù)報(bào)道,在壯苗培養(yǎng)階段,在培養(yǎng)基中添加一些物質(zhì)如GA3[19]、VB1[20]、蛋白胨[20,21]、水解酪蛋白[22]等,可有效提高種苗的生長(zhǎng)勢(shì),另有研究表明種苗在含高濃度的細(xì)胞分裂素上生長(zhǎng)后適當(dāng)降低或去除細(xì)胞分裂素,對(duì)壯苗有一定的促進(jìn)作用[4]。常立國(guó)等[23]將馬鈴薯弱苗放置于不含激素的3MS上生長(zhǎng),壯苗效果最佳,莖稈粗壯、葉片多、葉面積大。本研究使用了不添加激素的MS培養(yǎng)基和MS+EDTA-Fe 2種培養(yǎng)基,MS培養(yǎng)基對(duì)壯苗有一定的效果,但MS+EDTA-Fe培養(yǎng)基壯苗效果更優(yōu)。于艷等[24]在建立多年生麻櫟組培體系過(guò)程中,初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中均使用2倍鐵鹽,有效提高了多年生麻櫟莖段的不定芽誘導(dǎo)率和再生植株成活率;Papathanasiou等[25]報(bào)道將培養(yǎng)基中的可溶性鐵濃度降低后,馬鈴薯種苗在隨后的培養(yǎng)中出現(xiàn)枯黃的現(xiàn)象,這些報(bào)道均說(shuō)明了鐵鹽對(duì)于組培苗尤其是葉片生長(zhǎng)具有重要的促進(jìn)作用。本研究在MS培養(yǎng)基中另外增加了10 mL/L EDTA-Fe后,種苗生長(zhǎng)健壯,葉色濃綠,證明該濃度的鐵鹽適合青牛膽種苗生長(zhǎng)。
研究了不同節(jié)間對(duì)腋芽誘導(dǎo)的影響,確定了適合用作外植體的具體節(jié)間位置,并篩選了壯苗培養(yǎng)基,該組織培養(yǎng)體系可為青牛膽的工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)指導(dǎo)。