李夢丹，王美玲，郭仰東，張喜春

（1.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，北京 100193）

番茄（Solanum lycopersicum）是世界上最重要的蔬菜之一，由于其品種多樣、營養(yǎng)豐富、用途廣泛等優(yōu)點，目前已經(jīng)成為人們?nèi)粘Ｉ钪凶钚枰氖卟酥唬?］。番茄是喜溫植物，多數(shù)番茄品種在溫度低于10℃時生長發(fā)育受阻，當(dāng)溫度低于6℃時表現(xiàn)明顯的冷害癥狀［2］。冷害會破壞植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，從而引起植株代謝失調(diào)、活性氧積累，進而破壞細(xì)胞生理和生化代謝過程，給其產(chǎn)量造成了較大的損失［3］。

當(dāng)植物遇到低溫脅迫時，為了適應(yīng)脅迫帶來的傷害，會激活一系列細(xì)胞反應(yīng)和分子機制，從而導(dǎo)致多種植物基因表達(dá)的改變，這些基因的產(chǎn)物可以直接保護植物免受脅迫，或者進一步控制其他靶基因的表達(dá)。進而引起一系列的理化反應(yīng)，建成一個信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以提高植物對逆境脅迫的耐受性［4-7］。其中，在植物響應(yīng)和抵抗環(huán)境脅迫的研究中，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多重要的轉(zhuǎn)錄因子，主要包括MYB［8］、WRKY［9］、bZIP［10］、NAC［11］等轉(zhuǎn)錄因子。

轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor，TF），也稱為反式作用因子，通常是指由基因編碼的一類蛋白質(zhì)，這些基因與基因啟動子區(qū)域的相關(guān)順式作用元件特異性結(jié)合，從而激活基因表達(dá)［12］。MYB類轉(zhuǎn)錄因子是重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，根據(jù)MYB域的數(shù)量，MYB家族可分為四類，1R-、R2R3-、3R-和4R-MYB蛋白［13-16］。R2R3-MYB蛋白是植物特有的，是植物中最豐富的物種，在植物的基因組中大約有100多個R2R3-MYB成員，積極參與植物生長發(fā)育、次生代謝以及生物和非生物脅迫應(yīng)答［17］。

目前，在番茄中MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能研究主要集中在番茄果實成熟以及非生物脅迫方面。已有研究表明，低溫、干旱和赤霉素等多種脅迫和激素可以誘導(dǎo)SlMYB113的表達(dá)，SlMYB113的過表達(dá)能夠增加花青素的積累，進而提高轉(zhuǎn)基因番茄的低溫耐受性［18］；在對番茄R2R3-MYB家族的51個基因做表達(dá)分析時，其中響應(yīng)NaCl處理的基因有10個，響應(yīng)ABA處理的基因有11個，響應(yīng)低溫脅迫的基因有14個，說明番茄R2R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子積極參與植物的非生物脅迫響應(yīng)［19］。因此，轉(zhuǎn)錄因子與激素相互作用的機制和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)調(diào)控所依賴的途徑和所發(fā)揮的作用各不相同。

在前期MYB102基因研究中發(fā)現(xiàn)，該基因啟動子序列包含的順式作用元件中，大部分與逆境或激素響應(yīng)等相關(guān)，還有光反應(yīng)元件以及細(xì)胞分化和分生組織生長相關(guān)元件。其中，響應(yīng)的逆境類型包括8個，響應(yīng)相關(guān)激素類型包括2個生長素相關(guān)元件、4個脫落酸相關(guān)元件和1個水楊酸相關(guān)元件［20］。以此為基礎(chǔ)，本研究以番茄幼苗為試驗材料，通過噴施SA、IAA、GA3、6-BA、ABA、MeJA 6種外源激素，研究其對番茄轉(zhuǎn)錄因子SlMYB102基因表達(dá)量的影響，進而了解6種外源激素對SlMYB102轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答低溫脅迫的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及取樣

以實驗室自存俄羅斯栽培番茄品種Bolgogragsky（實驗室種質(zhì)編號25）為材料。將番茄種子暗培養(yǎng)3～5 d催芽后播種育苗，并置于25/20℃（16/8 h，60%濕度，光照12 000 lx）的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。三葉一心時分苗至10 cm×10 cm營養(yǎng)缽中，進行常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)幼苗長至四葉一心時進行外源激素處理試驗，外源激素采用SA（500μmol/L）、MeJA（100μmol/L）、GA3（400μmol/L）、ABA（100μmol/L）、IAA（100μmol/L）、6-BA（300 mg/L），以噴施去離子水作為對照處理。噴施過程中，葉正、背面均噴施，以表面附著一層液珠為準(zhǔn)。每隔2 d噴施1次，共噴施3次。經(jīng)激素處理的番茄幼苗置于4℃恒溫培養(yǎng)箱中，分別在低溫處理0、1、3、6、9、12、24 h時取番茄葉片于液氮中，并保存在超低溫冰箱中，用于后續(xù)基因表達(dá)量的檢測。試驗至少進行3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與cDNA的合成 RNA提取采用Trizol試劑提取法。RNA提取后進行濃度和質(zhì)量檢測，將良好的RNA樣品放于-80℃冰箱保存，用于后續(xù)試驗。利用全式金的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體方法參照說明書。

1.2.2 實時熒光定量PCR 根據(jù)SlMYB102基因和內(nèi)參基因Actin序列，設(shè)計熒光定量PCR引物（qRTPCR F：TGGTCTGCTATTGCTGCACG；qRT-PCR R：CGTGGACTGTGTGTCACTGG）。反應(yīng)體系見表1，反應(yīng)程序見表2，基因的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計算。

表1 qRT-PCR反應(yīng)體系

表2 qRT-PCR反應(yīng)程序

利用TB Green Fast q PCR Mix在Step One Plus Real-Time PCR System（Thermo Fisher）上運行反應(yīng)，循環(huán)40次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)處理采用2010版Microsoft Excel進行處理，數(shù)據(jù)的方差分析與顯著性測試采用SPSS26.0軟件進行，采用單因素方差分析（ANOVA）進行數(shù)據(jù)比較，利用Duncan’s新復(fù)極差法檢驗處理間差異的顯著性水平，并在P＜0.05水平上進行檢驗。

2 結(jié)果與分析

如圖1所示，在MeJA、GA3、IAA 3種激素處理下，SlMYB102基因的相對表達(dá)水平在1 h都出現(xiàn)上調(diào)，其中MeJA處理下上調(diào)倍數(shù)較高，高達(dá)8倍左右。隨時間延長，在MeJA、GA3、IAA 3種激素處理下，SlMYB102的表達(dá)水平下降，在6 h又迅速上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)達(dá)到最高，分別高達(dá)15倍、10倍和5倍左右，隨后下調(diào)，在IAA處理下，24 h又出現(xiàn)了上調(diào)趨勢；而在6-BA和ABA 2種激素處理下，SlMYB102的基因相對表達(dá)水平在9 h達(dá)到最高，分別為3倍和8倍左右，隨后下降；在SA處理下，SlMYB102基因的相對表達(dá)量在9 h出現(xiàn)顯著上調(diào)，高達(dá)14倍，隨后下降，在24 h顯著上調(diào)，高達(dá)38倍。

圖1 SlMYB102基因在不同激素處理下的表達(dá)模式分析

3 討論

低溫冷害每年給蔬菜作物造成嚴(yán)重的危害，已有很多方法用來提高蔬菜作物的耐低溫能力，最直接的改善番茄對低溫抗性是選育耐低溫的新品種［21］。解決番茄低溫脅迫的最方便的是通過分子生物學(xué)技術(shù)將與抗寒性相關(guān)的基因轉(zhuǎn)入栽培的番茄品種中，或者提高番茄植株體內(nèi)與抗寒相關(guān)基因的表達(dá)量來提高番茄品種的抗寒性。這種方法既可以避免優(yōu)良基因的丟失，又可挖掘植物體內(nèi)與抗寒相關(guān)的功能基因，為今后的番茄抗寒性育種提供理論支撐［22］。

植物對于非生物脅迫的抵抗能力與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)功能密切相關(guān)。在植物進化過程中，MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能也變得更加多樣化。MYB轉(zhuǎn)錄因子普遍分布于植物中，基本涉及植物生長和代謝的所有過程［23］。研究已發(fā)現(xiàn)非生物脅迫（如低溫、干旱等）能誘導(dǎo)植物體內(nèi)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進一步直接影響或者間接調(diào)控一些抗性相關(guān)基因的表達(dá)，啟動防御機制抵抗外界不良環(huán)境［24］。在本研究中番茄SlMYB102基因是MYB家族中R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子，已有研究表明，番茄SlMYB102受NaCl、ABA以及低溫3種非生物脅迫誘導(dǎo)，在3種脅迫誘導(dǎo)下，SlMYB102基因表達(dá)量都會上升［25，26］。在轉(zhuǎn)錄因子的啟動子中存在多種作用元件，非生物脅迫誘導(dǎo)啟動子順式作用元件與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，在分子水平上調(diào)節(jié)植物對非生物脅迫的抗性［27］。而本試驗研究的SlMYB102啟動子的作用元件包括多種與激素相關(guān)的元件。

激素在植物抗寒調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中也發(fā)揮了重要作用。比如外源ABA可以提高甘蔗的抗寒性，外源ABA、GA3和6-BA對冬小麥的抗寒性有所幫助，茉莉酸甲酯處理對青椒冷藏過程中膜脂代謝影響的研究表明，MeJA可改善青椒的冷害狀況等［28-30］。本試驗結(jié)果表明，在ABA、GA3、IAA、SA、6-BA、MeJA 6種植物激素的誘導(dǎo)下，SlMYB102基因?qū)τ?種不同激素均有響應(yīng)，并呈上調(diào)表達(dá)模式，并且此結(jié)果與啟動子順式作用元件分析相符合，SlMYB102作為MYB轉(zhuǎn)錄因子R2R3-MYB亞家族的基因，推測SlMYB102基因可能也參與到激素對植物抗寒的調(diào)控通路上。有研究克隆了R2R3類型MYB轉(zhuǎn)錄因子AtMYB15發(fā)現(xiàn)，該基因受低溫誘導(dǎo)表達(dá)，可同ICE1互作并與CBF基因啟動子區(qū)域的MYB順式元件結(jié)合，從而提高擬南芥植株抗寒性［31］。紫甘藍(lán)遭受低溫脅迫時可以通過基因BoPAP1的急速上調(diào)來促進花青素的合成從而抵御寒冷［32］。還有研究表明，ABA、GA都參與到了植物生長發(fā)育和對非生物脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)中［33］。在葡萄休眠芽中外源施用ABA可提高CBF/DREB1轉(zhuǎn)錄因子VvCBF2、VvCBF3、VvCBF4和VvCBF6的表達(dá)［34］。

目前，MYB轉(zhuǎn)錄因子與激素之間的研究較少。尤其MYB類轉(zhuǎn)錄因子中作為與抗性有關(guān)的一類基因，在將來的研究中可以將其與環(huán)境脅迫相關(guān)的植物激素相結(jié)合，進行更深入的研究。