王晚翠，馬 倩，暨迪軍，劉明珠，盧永昌

（青海民族大學藥學院/青海省青藏高原植物資源化學研究重點實驗室/青海省藥物分析重點實驗室/青海省現(xiàn)代藏藥創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心，西寧 810007）

高原毛茛（Ranunculusbrotherusii）為毛茛目被子植物，多年生草本，生于海拔3 000～4 500 m的山坡或溝邊沼澤濕地，分布于西藏、云南西北部、四川西部、陜西、甘肅、青海、山西及河北等地區(qū)。尼泊爾、印度北部也有分布。全草藥用，有清熱解毒之效，治淋巴結(jié)核等癥，消炎退腫，平喘，截瘧，用于感冒，瘰疬。外用于牛皮癬。藏藥名杰察，辛，溫，有小毒［1，2］。常用于提升胃溫，愈瘡，引黃水，用于收斂潰爛喉癥，腹水，黃水病，頭昏脹以及寒性腫瘤。黃酮類化合物是一類植物次生代謝產(chǎn)物，在多種植物中均有分布，具有抗氧化、抑菌［3］、防止血管增生、抗病毒、降血糖、降血脂、抗骨質(zhì)疏松等多種生物活性［4］。

1 材料與方法

1.1 藥材

高原毛茛于2019年8月采自青海玉樹。經(jīng)青海民族大學盧永昌教授鑒定為高原毛茛，標本存于青海民族大學藥學院標本室。

1.2 儀器

T6紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；HH-6恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；ME2353電子天平，北京賽多利斯儀器有限公司；超聲清洗儀，昆山潔力美超聲儀器有限公司；SHB-B88循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.3 試劑

蘆丁對照品，都萊生物有限公司，批號：N1811260038；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、乙醇均為分析純。

1.4 方法

1.4.1 對照品溶液的制備 準確稱量蘆丁標準品20.1 mg，置于50 mL容量瓶中，加入適量60%乙醇溶液，超聲至完全溶解呈澄清透明狀，繼續(xù)用60%乙醇溶液定容至刻度線，即得到質(zhì)量濃度為0.402mg/mL的蘆丁標準品溶液［5］。

1.4.2 供試品溶液的制備 準確稱取高原毛茛1.0 g，置于錐形瓶中，加入60%乙醇溶液45 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取1.0 h，冷卻至室溫，稱定質(zhì)量，用60%乙醇溶液補足缺失的質(zhì)量，過濾，取續(xù)濾液，做為供試品溶液備用［6］。

1.4.3 標準曲線的繪制 準確吸取蘆丁對照品溶液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL于25 mL容量瓶中，加入1.00 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min；加入1.00 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液10.00 mL，搖勻，用60%乙醇溶液定容，搖勻，靜置15 min。按照順序向60%乙醇溶液中加入亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，作為空白溶液，在510 nm處測定各個溶液的吸光度。以蘆丁標準品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，其線性回歸方程為Y=12.754X+0.022 9（r=0.999 6）［7］。

1.4.4 單因素試驗考察

1）提取方法對總黃酮含量的影響。分別稱取4份高原毛茛，每份1.0 g，各加入40 mL 60%乙醇溶液，分別采用浸提法、超聲法、煎煮法、熱回流法提取1.0 h，過濾后用紫外分光光度計測定濾液吸光度，并計算其總黃酮含量。

2）提取時間對總黃酮含量的影響。分別準確稱取5份高原毛茛，每份1.0 g，置于錐形瓶中，各加入40 mL 60%乙醇溶液，使用超聲提取法分別提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，過濾后用紫外分光光度計測定濾液吸光度，并計算其總黃酮含量。

3）料液比對總黃酮含量的影響。分別準確稱取5份高原毛茛，每份1.0 g，置于錐形瓶中，設置料液比分別為1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55，60%乙醇溶液作為溶劑，超聲提取法提取1.5 h，過濾后用紫外分光光度計測定濾液吸光度，并計算其總黃酮含量。

4）乙醇體積分數(shù)對總黃酮含量的影響。分別準確稱取5份高原毛茛，每份1.0 g，置于錐形瓶中，分別加入40 mL 40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，超聲提取法提取1.0 h，過濾后用紫外分光光度計測定濾液吸光度，并計算其總黃酮含量。

1.4.5 正交試驗 通過對不同提取方法、不同提取時間、不同料液比及不同乙醇體積分數(shù)進行考察，選擇對高原毛茛中總黃酮提取影響較大的因素進行正交試驗，并以得到的最優(yōu)試驗方案進行驗證［8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 提取時間對高原毛茛總黃酮的影響 如圖1所示，總黃酮吸光度隨時間的延長先增大后降低。當提取時間延長至1.0 h后，總黃酮吸光度呈下降，即最佳時間為1.0 h。

圖1 提取時間對高原毛茛總黃酮的影響

2.1.2 提取方法對高原毛茛總黃酮的影響 如圖2所示，用超聲提取法提取高原毛茛中的總黃酮時吸光度最大，其次是熱回流法和煎煮法，冷浸法得到的總黃酮吸光度最低。

圖2 提取方法對高原毛茛總黃酮的影響

2.1.3 料液比對高原毛茛總黃酮的影響 如圖3所示，隨著溶劑的增加，高原毛茛中總黃酮吸光度增大，當料液比達到1∶45時，高原毛茛中總黃酮吸光度最高。當溶劑進一步增大時，高原毛茛中總黃酮的吸光度又呈下降的趨勢，即最佳料液比為1∶45。

圖3 料液比對高原毛茛總黃酮的影響

2.1.4 乙醇體積分數(shù)對高原毛茛總黃酮的影響 如圖4所示，高原毛茛總黃酮吸光度隨著乙醇體積分數(shù)的增加，呈先上升后下降的趨勢。當乙醇體積分數(shù)為70%時，總黃酮吸光度最高。

圖4 乙醇體積分數(shù)對高原毛茛總黃酮的影響

2.2 正交試驗

單因素試驗考察發(fā)現(xiàn)，乙醇體積分數(shù)、提取時間、料液比對提取量影響較大，對總黃酮影響的大小順序為乙醇體積分數(shù)＞提取時間＞料液比，因此選擇提取時間、料液比、乙醇體積分數(shù)3個因素進行正交試驗設計，每個因素均設置3個水平（表1）。由表2可知，高原毛茛中總黃酮提取的最佳條件組合為A3B1C3，即提取時間為1.0 h，70%乙醇溶液，料液比為1∶55，此時所得總黃酮含量為1.67 mg/g。

表1 正交因素與水平

表2 正交試驗結(jié)果

2.3 驗證試驗

采用正交法得到的最佳條件，即70%乙醇溶液，料液比1∶55，超聲條件下提取1.0 h，重復5次，所得到高原毛茛總黃酮平均含量為1.648 mg/g。

3 結(jié)論

通過單因素試驗考察及正交試驗結(jié)果可知，影響總黃酮含量的因素依次為乙醇體積分數(shù)、提取時間、料液比，最佳提取工藝條件為70%乙醇溶液提取1.0 h，料液比為1∶55。所得總黃酮含量較高，且提取方法較為簡便、可操作性強、易于重現(xiàn)，可作為高原毛茛藥材質(zhì)量評價的依據(jù)。