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        高原毛茛總黃酮含量測定及提取工藝研究

        2021-09-01 03:49:44王晚翠暨迪軍劉明珠盧永昌
        湖北農(nóng)業(yè)科學 2021年15期
        關(guān)鍵詞:黃酮

        王晚翠,馬 倩,暨迪軍,劉明珠,盧永昌

        (青海民族大學藥學院/青海省青藏高原植物資源化學研究重點實驗室/青海省藥物分析重點實驗室/青海省現(xiàn)代藏藥創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心,西寧 810007)

        高原毛茛(Ranunculusbrotherusii)為毛茛目被子植物,多年生草本,生于海拔3 000~4 500 m的山坡或溝邊沼澤濕地,分布于西藏、云南西北部、四川西部、陜西、甘肅、青海、山西及河北等地區(qū)。尼泊爾、印度北部也有分布。全草藥用,有清熱解毒之效,治淋巴結(jié)核等癥,消炎退腫,平喘,截瘧,用于感冒,瘰疬。外用于牛皮癬。藏藥名杰察,辛,溫,有小毒[1,2]。常用于提升胃溫,愈瘡,引黃水,用于收斂潰爛喉癥,腹水,黃水病,頭昏脹以及寒性腫瘤。黃酮類化合物是一類植物次生代謝產(chǎn)物,在多種植物中均有分布,具有抗氧化、抑菌[3]、防止血管增生、抗病毒、降血糖、降血脂、抗骨質(zhì)疏松等多種生物活性[4]。

        1 材料與方法

        1.1 藥材

        高原毛茛于2019年8月采自青海玉樹。經(jīng)青海民族大學盧永昌教授鑒定為高原毛茛,標本存于青海民族大學藥學院標本室。

        1.2 儀器

        T6紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司;HH-6恒溫水浴鍋,金壇市杰瑞爾電器有限公司;ME2353電子天平,北京賽多利斯儀器有限公司;超聲清洗儀,昆山潔力美超聲儀器有限公司;SHB-B88循環(huán)水式多用真空泵,鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

        1.3 試劑

        蘆丁對照品,都萊生物有限公司,批號:N1811260038;氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、乙醇均為分析純。

        1.4 方法

        1.4.1 對照品溶液的制備 準確稱量蘆丁標準品20.1 mg,置于50 mL容量瓶中,加入適量60%乙醇溶液,超聲至完全溶解呈澄清透明狀,繼續(xù)用60%乙醇溶液定容至刻度線,即得到質(zhì)量濃度為0.402mg/mL的蘆丁標準品溶液[5]。

        1.4.2 供試品溶液的制備 準確稱取高原毛茛1.0 g,置于錐形瓶中,加入60%乙醇溶液45 mL,稱定質(zhì)量,超聲提取1.0 h,冷卻至室溫,稱定質(zhì)量,用60%乙醇溶液補足缺失的質(zhì)量,過濾,取續(xù)濾液,做為供試品溶液備用[6]。

        1.4.3 標準曲線的繪制 準確吸取蘆丁對照品溶液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL于25 mL容量瓶中,加入1.00 mL 5%亞硝酸鈉溶液,搖勻,靜置6 min;加入1.00 mL 10%硝酸鋁溶液,搖勻,靜置6 min,加入4%氫氧化鈉溶液10.00 mL,搖勻,用60%乙醇溶液定容,搖勻,靜置15 min。按照順序向60%乙醇溶液中加入亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉,作為空白溶液,在510 nm處測定各個溶液的吸光度。以蘆丁標準品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線,其線性回歸方程為Y=12.754X+0.022 9(r=0.999 6)[7]。

        1.4.4 單因素試驗考察

        1)提取方法對總黃酮含量的影響。分別稱取4份高原毛茛,每份1.0 g,各加入40 mL 60%乙醇溶液,分別采用浸提法、超聲法、煎煮法、熱回流法提取1.0 h,過濾后用紫外分光光度計測定濾液吸光度,并計算其總黃酮含量。

        2)提取時間對總黃酮含量的影響。分別準確稱取5份高原毛茛,每份1.0 g,置于錐形瓶中,各加入40 mL 60%乙醇溶液,使用超聲提取法分別提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h,過濾后用紫外分光光度計測定濾液吸光度,并計算其總黃酮含量。

        3)料液比對總黃酮含量的影響。分別準確稱取5份高原毛茛,每份1.0 g,置于錐形瓶中,設置料液比分別為1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55,60%乙醇溶液作為溶劑,超聲提取法提取1.5 h,過濾后用紫外分光光度計測定濾液吸光度,并計算其總黃酮含量。

        4)乙醇體積分數(shù)對總黃酮含量的影響。分別準確稱取5份高原毛茛,每份1.0 g,置于錐形瓶中,分別加入40 mL 40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液,超聲提取法提取1.0 h,過濾后用紫外分光光度計測定濾液吸光度,并計算其總黃酮含量。

        1.4.5 正交試驗 通過對不同提取方法、不同提取時間、不同料液比及不同乙醇體積分數(shù)進行考察,選擇對高原毛茛中總黃酮提取影響較大的因素進行正交試驗,并以得到的最優(yōu)試驗方案進行驗證[8]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素試驗結(jié)果

        2.1.1 提取時間對高原毛茛總黃酮的影響 如圖1所示,總黃酮吸光度隨時間的延長先增大后降低。當提取時間延長至1.0 h后,總黃酮吸光度呈下降,即最佳時間為1.0 h。

        圖1 提取時間對高原毛茛總黃酮的影響

        2.1.2 提取方法對高原毛茛總黃酮的影響 如圖2所示,用超聲提取法提取高原毛茛中的總黃酮時吸光度最大,其次是熱回流法和煎煮法,冷浸法得到的總黃酮吸光度最低。

        圖2 提取方法對高原毛茛總黃酮的影響

        2.1.3 料液比對高原毛茛總黃酮的影響 如圖3所示,隨著溶劑的增加,高原毛茛中總黃酮吸光度增大,當料液比達到1∶45時,高原毛茛中總黃酮吸光度最高。當溶劑進一步增大時,高原毛茛中總黃酮的吸光度又呈下降的趨勢,即最佳料液比為1∶45。

        圖3 料液比對高原毛茛總黃酮的影響

        2.1.4 乙醇體積分數(shù)對高原毛茛總黃酮的影響 如圖4所示,高原毛茛總黃酮吸光度隨著乙醇體積分數(shù)的增加,呈先上升后下降的趨勢。當乙醇體積分數(shù)為70%時,總黃酮吸光度最高。

        圖4 乙醇體積分數(shù)對高原毛茛總黃酮的影響

        2.2 正交試驗

        單因素試驗考察發(fā)現(xiàn),乙醇體積分數(shù)、提取時間、料液比對提取量影響較大,對總黃酮影響的大小順序為乙醇體積分數(shù)>提取時間>料液比,因此選擇提取時間、料液比、乙醇體積分數(shù)3個因素進行正交試驗設計,每個因素均設置3個水平(表1)。由表2可知,高原毛茛中總黃酮提取的最佳條件組合為A3B1C3,即提取時間為1.0 h,70%乙醇溶液,料液比為1∶55,此時所得總黃酮含量為1.67 mg/g。

        表1 正交因素與水平

        表2 正交試驗結(jié)果

        2.3 驗證試驗

        采用正交法得到的最佳條件,即70%乙醇溶液,料液比1∶55,超聲條件下提取1.0 h,重復5次,所得到高原毛茛總黃酮平均含量為1.648 mg/g。

        3 結(jié)論

        通過單因素試驗考察及正交試驗結(jié)果可知,影響總黃酮含量的因素依次為乙醇體積分數(shù)、提取時間、料液比,最佳提取工藝條件為70%乙醇溶液提取1.0 h,料液比為1∶55。所得總黃酮含量較高,且提取方法較為簡便、可操作性強、易于重現(xiàn),可作為高原毛茛藥材質(zhì)量評價的依據(jù)。

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