劉 浩， 路明磊， 黃曉衛(wèi),2， 王 娜,2， 王雪芳,2， 寧 新， 明津法,

(1. 青島大學 紡織服裝學院， 山東 青島 266071； 2. 青島大學 非織造材料與產業(yè)用紡織品創(chuàng)新研究院，山東 青島 266071； 3. 山東省特型非織造材料工程研究中心， 山東 青島 266071)

水凝膠是一種集吸水、保水、緩釋為一體的功能高分子材料，本質上類似于細胞外基質[1]，信號可以在其中傳遞、響應。目前，天然聚合物以其獨特的生物特性已廣泛應用于水凝膠的制備，其中絲素蛋白(SF)作為一種典型材料活躍于組織工程[2]、生物礦化[3-4]、智能[5-6]等領域。

SF是一種天然高分子材料，具有良好的生物相容性和可降解性[7-8]，在一定程度上表現(xiàn)為動力學穩(wěn)定性和熱力學不穩(wěn)定性[9]。在水溶液中，SF分子在親疏水作用下往往自組裝成納米微球，從動力學角度來看，納米微球在無時無刻做著劇烈的布朗運動，由于中性條件下帶有負電的SF分子微球間存在著靜電斥力，阻礙了微球的進一步凝聚，在一定時間內溶液處于穩(wěn)定狀態(tài)[10]；但長時間的靜置或在溫度、pH值、極性溶液等外界因素的干擾下[11]，這種熱力學穩(wěn)定狀態(tài)最終會因疏水、氫鍵、靜電等非共價鍵作用而被破壞，實現(xiàn)物理交聯(lián)，導致微球的凝聚和析出，最終形成一種相對穩(wěn)定的凝膠網絡結構[12-13]，這種凝膠過程往往伴隨著SF分子由無規(guī)卷曲向β-折疊構象的轉變[14]。在酸性條件下，SF分子間的靜電斥力減弱，無電荷羧基的疏水性增強，引發(fā)了較強的鏈間集聚[12,15]。針對SF的這一特點，逐漸延伸出了多種凝膠工藝，如常規(guī)酸滴定法[16]、揮發(fā)性電解質誘導法(如高壓二氧化碳誘導[17])、電場誘導法[18]等。其中，揮發(fā)性電解質誘導法是一種比較新的凝膠方法，較常規(guī)酸滴定法具有明顯的優(yōu)勢，避免過多酸的殘留對SF水凝膠結構造成二次破壞；同時，在密閉容器中酸的揮發(fā)會引起壓強的變化，有利于SF溶液緩慢而均勻的酸化，促使SF溶液凝膠自上而下漸進式進行，使結構具有一定的取向性。

因材料自身因素影響，常見的SF水凝膠往往表現(xiàn)出力學性能差，凝膠成形困難等問題，且很大程度上仍然依賴于添加合適的材料來滿足設計需要[19]，隨著合成高分子聚合物的廣泛應用，為水凝膠性能的可控性和可復制性提供了支持[20-21]。如通過添加表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)獲得的SF水凝膠具有良好的力學性能，其壓縮模量最高可達到3.0 MPa[22]；此外，將SF與聚丙烯酰胺組合，其壓縮強度可達到122 MPa(應變?yōu)?2%時)[23]。然而過多合成材料的引入不可避免會對SF的結構與生物性能產生一系列影響，限制其在生物醫(yī)藥等領域的進一步應用，因此，引入具有相容性、無毒性的材料和對SF進行物理加工是當前提高絲素蛋白水凝膠性能的常見方法[24]。為改善SF水凝膠的力學性能和提高凝膠速率，本文提出了一種乙酸-乙醇體系共同促進SF凝膠的方法制備結構均勻、形貌可控的纖維結構SF水凝膠，探索了水凝膠內部纖維結構的成形條件以及不同形貌下水凝膠的結構與性能差異，并測試分析了不同質量分數(shù)乙醇輔助誘導下獲得SF水凝膠的聚集態(tài)結構變化，對其力學性能進行表征，以期為細胞或晶體材料提供一個穩(wěn)定的生長空間，拓寬其在醫(yī)學、電子等領域的應用。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與儀器

材料：桑蠶絲，產自山東省；無水碳酸鈉、無水氯化鈣、無水乙醇、乙酸(冰醋酸)、己烷，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；透析袋，相對分子質量為3 500，上海雷布斯生物科技有限公司；去離子水，實驗室自制。

儀器：S4800掃描電子顯微鏡(SEM)，日本日立公司；Nicolet5700 傅里葉紅外光譜儀(FT-IR)， 美國賽默飛世爾科技公司；Ultima IV 系列X射線衍射儀(XRD)，日本理學株式會社；in Via 共聚焦顯微鏡拉曼光譜儀，英國雷尼紹公司；TGA/DSC3+LF同步熱分析儀，瑞士梅特勒-托利多公司；Instron 3382雙立柱落地式電子萬能材料試驗機，美國英斯特朗公司；HJ-6多頭磁力攪拌器、HD101a-3電熱鼓風干燥箱，青島創(chuàng)合盛科教儀器設備有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；VPK-1-10T優(yōu)普系列小型超純水機，四川優(yōu)普超純科技有限公司。

1.2 可控形貌SF水凝膠的制備

根據(jù)文獻[25-26]中的方法對蠶絲進行脫膠處理。首先，將蠶絲按照1∶50的浴比放入0.05%碳酸鈉溶液中煮沸處理30 min，取出后用蒸餾水反復清洗，重復上述操作3次后烘干。然后，將已脫膠的蠶絲(8%)置于氯化鈣-乙醇-水(量比為1∶2∶8)三元溶液中，在60 ℃下攪拌至完全溶解[27]。冷卻至室溫后，將上述液體轉移到相對分子質量為3 500的透析袋中，在流動的去離子水中透析72 h，經過脫脂棉過濾后即得到3.0%的SF溶液。

取2 g乙酸于120 mm玻璃干燥器底部，靜置一段時間至乙酸氣體均勻分布，再另取10 g上述SF溶液倒入直徑為35 mm的培養(yǎng)皿中，快速放于干燥器的隔板上，靜置12～14 h即得到SF水凝膠。乙醇能夠剝奪與SF相結合的水分子，促使SF分子鏈的重新組合，形成密集的氫鍵作用[28-30]，縮短凝膠時間。故本文向SF中緩慢加入無水乙醇，其質量分數(shù)分別為1.0%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%，混合均勻后置于乙酸環(huán)境中，1 h左右即可獲得具有不同形貌的SF水凝膠。如果乙醇質量分數(shù)過高，凍干后的樣品將無法成形，實驗參數(shù)如表1所示。

表1 絲素蛋白水凝膠實驗參數(shù)Tab.1 Specification parameters of silk fibroin hydrogels

1.3 性能測試與表征

1.3.1 水凝膠形貌觀察及直徑測試

將凍干后的SF水凝膠切片后用導電膠貼在工作臺上，噴金處理60 s。采用背散射模式、標準束流，通過掃描電子顯微鏡觀察樣品形貌，加速電壓為10 kV。然后將樣品的掃描電鏡照片導入Nano Measurer 1.2軟件中，隨機選取50根纖維進行直徑測量，計算水凝膠內部纖維直徑的平均值及偏差。

1.3.2 水凝膠聚集態(tài)結構測試

取適量凍干后的水凝膠樣品于研缽中，加入溴化鉀研磨均勻，壓片并在傅里葉紅外光譜儀中進行測試。儀器的分辨率為4 cm-1，掃描32次，檢測范圍為4 000～400 cm-1。譜圖的采集和分析均使用Thermo Fisher公司的OMNIC 8.0軟件，并將獲得的數(shù)據(jù)導入到Origin中進行繪制。此外，選取1 700～1 600 cm-1波數(shù)范圍內的紅外光譜圖導入PeakFit v4.12軟件，采用傅里葉自去卷積法對酰胺I帶進行分峰擬合，得到各二級結構子峰的分布和強度，并通過計算各子峰的積分面積即可得到SF水凝膠內部各聚集態(tài)結構的相對百分比含量，從而分析乙酸-乙醇體系對SF聚集態(tài)結構的影響[31-33]。設置的擬合峰類型為高斯/洛倫茲型，帶寬為50 cm-1，增強因子為3.0。

利用X射線衍射儀對水凝膠內部的結晶結構進行測試，衍射角范圍為5°～45°，掃描速度為2 (°)/min，管電流為40 mA，管電壓為40 kV，CuKα靶(波長λ=0.154 18 nm)。此外，通過拉曼光譜儀在2 000～500 cm-1范圍內進行掃描，進一步驗證水凝膠內部聚集態(tài)結構變化情況，測試激發(fā)波長為632.8 nm。

1.3.3 水凝膠熱穩(wěn)定性能測試

取3～4 mg SF水凝膠樣品于40 mL鋁干鍋中，通過同步熱分析儀獲得不同樣品的熱穩(wěn)定性能。溫度范圍為25～400 ℃，升溫速度為10 ℃/min。樣品始終處于氮氣氛圍中，流速為50 mL/min。

1.3.4 水凝膠孔隙率與吸水率測試

將不同乙醇質量分數(shù)的SF水凝膠制成直徑為14 mm、高為10 mm的圓柱體，凍干后記錄其干態(tài)質量為m0(mg)；然后將樣品浸泡在去離子水中，水浴加熱使溫度保持在37 ℃，2 h后取出樣品并用濾紙吸去樣品表面殘留的水珠，記錄此時樣品的濕態(tài)質量m1(mg)。每種樣品重復5次測試取平均值。吸水率(Rmc)根據(jù)下式[34]進行計算：

SF水凝膠的孔隙率采用液體置換法進行計算[35]。室溫下將上述樣品浸泡在裝有已知體積的己烷(V0(mL))的量筒中，記錄當前樣品和液體的總體積為V1(mL)；5 min后取出樣品，量筒中剩余己烷體積為V2(mL)，則樣品的孔隙率(E)通過下式計算得到：

1.3.5 水凝膠壓縮性能測試

使用24孔板將SF水凝膠制成直徑為14 mm、高為15 mm的圓柱體。在標準大氣環(huán)境下通過電子萬能材料試驗機分別檢測SF水凝膠樣品在干態(tài)和濕態(tài)下的壓縮性能以及韌性。在干態(tài)測試中，儀器的壓縮速率為10 mm/min，將凍干的水凝膠樣品壓縮至自身形變的60%[36]；在濕態(tài)測試中，先將樣品于磷酸鹽緩沖液(PBS)中浸潤，取出后在60%的壓縮應變下進行5次循環(huán)壓縮-釋放，得到循環(huán)應力與應變關系曲線。每種樣品重復5組測試，取平均值分析水凝膠樣品在循環(huán)過程中的應力變化情況和回復性能。

2 結果與討論

2.1 SF水凝膠的形貌分析

乙酸氣體在密閉容器中的揮發(fā)緩慢改變著溶液pH值，絲素蛋白溶液受pH值梯度的影響自上而下緩慢凝膠，使結構取向延伸；同時乙醇質量分數(shù)的調節(jié)輔助誘導SF構象向β-折疊構象轉變，加快凝膠速率。圖1為在乙酸氛圍下，不同質量分數(shù)乙醇誘導SF水凝膠樣品的掃描電鏡照片?？梢钥闯?，隨著乙醇質量分數(shù)的增加，水凝膠內部結構發(fā)生明顯變化，纖維化越趨明顯，但如果乙醇的質量分數(shù)超過10.0%達到20.0%時，水凝膠凍干后將無法保持穩(wěn)定的立體骨架結構。當SF溶液中不含乙醇(SF-0)時，水凝膠內部均勻分布著尺寸在幾十到幾百微米的孔洞，孔壁較為光滑，厚度為(4.36±2.61)μm。隨著乙醇質量分數(shù)的增加，水凝膠內部結構向纖維化轉變，先是孔壁變得粗糙，由纖維堆砌而成，隨后纖維逐漸分離，交織成三維立體網絡結構。當乙醇質量分數(shù)達到5.0%(SF-5)時，纖維直徑為(1.09±0.5) μm，遠小于Floren等[17]通過高壓二氧化碳作為揮發(fā)性酸制備的纖維結構水凝膠(當質量分數(shù)在2.0%～4.0%時，直徑為(2.22±0.5)～(5.62±1.4) μm， 壓縮模量為(39.70±3.24)～(63.98±2.97) kPa)。 當乙醇的質量分數(shù)增大到10.0%時，纖維直徑增大到(1.53±0.73) μm，纖維上串聯(lián)的微球也愈發(fā)明顯。這種纖維結構具有較大的比表面積，為細胞生長或生物礦化提供了良好的粘附、生長空間，同時也影響著水凝膠的內在性能。

圖1 不同質量分數(shù)乙醇誘導絲素蛋白水凝膠的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.1 SEM images of SF hydrogels with different mass ratios of alcohol

2.2 SF水凝膠的聚集態(tài)結構分析

分別采用紅外光譜、拉曼、X射線衍射法分析SF水凝膠的聚集態(tài)結構變化。圖2示出不同質量分數(shù)乙醇誘導獲得SF水凝膠的拉曼光譜圖。拉曼曲線顯示所有樣品均在1 669、1 230、1 085 cm-1處出現(xiàn)明顯的特征峰，代表著β-折疊構象，其余聚集態(tài)結構的特征峰均不明顯。

圖2 不同質量分數(shù)乙醇誘導SF水凝膠的拉曼光譜圖Fig.2 Raman pattern of SF hydrogels with different mass fraction of alcohol

圖3(a)示出不同乙醇質量分數(shù)下水凝膠樣品的紅外光譜圖?？梢钥闯觯斠掖假|量分數(shù)為0%時，SF水凝膠的紅外特征峰主要集中在1 653 cm-1(無規(guī)卷曲)、1 625 cm-1(β-折疊)、1 525 cm-1(β-折疊)、1 234 cm-1(無規(guī)卷曲)處。結合圖3(c)SF水凝膠各二級結構合量變化發(fā)現(xiàn)，在不含乙醇條件下制備的絲素蛋白水凝膠內部以β-折疊構象為主，但無規(guī)卷曲構象所占比例仍然比較大。隨著乙醇質量分數(shù)的增加，1 653 cm-1處特征峰的中心逐漸向低波數(shù)位移；而1 625 cm-1(低波數(shù)β-折疊)處特征峰的強度逐漸變強，整體峰寬度逐漸變窄，相對集中在1 640～1 620 cm-1之間。此外，1 701 cm-1處峰強輕微下降并向低波數(shù)轉移，雖然沒有明顯偏移至1 698 cm-1(高波數(shù)β-折疊)，但峰型的改變也代表著SF聚集態(tài)結構發(fā)生了轉變。

圖3(b)示出乙醇質量分數(shù)為5.0%的水凝膠分峰圖譜，擬合曲線的相似度達到0.999以上。將酰胺I帶(1 700～1 600 cm-1)細分為10個子峰，通過各子峰的面積分析出聚集態(tài)結構在各階段所占比例[37]，如圖3(c)所示?？芍?，隨著乙醇質量分數(shù)的增大，β-折疊構象含量顯著提高，從最初的45.1%提高至50.5%左右，同時無規(guī)卷曲構象從22.3%下降到12.8%附近；當乙醇質量分數(shù)超過2.5%時，2種構象含量變化均趨于平緩；此外α-螺旋構象的含量也有了小幅度提高。上述結果可以發(fā)現(xiàn)，雖然乙酸也能促進絲素蛋白分子鏈轉變成β-折疊結構，但含量較低；相較來說，乙醇能夠快速促使水凝膠內部分子排列更加緊密，構象更加規(guī)整，β-折疊構象的含量也大幅度提高[28]。

圖3 不同質量分數(shù)乙醇誘導SF水凝膠的二級結構Fig.3 Secondary structure of SF hydrogels with different mass fraction of alcohol.(a)FT-IR spectra of SF hydrogels；(b)FT-IR peak fitting curve of SF-5 hydrogel in amide Ⅰ region；(c)Change of secondary structure of SF hydrogel in amide Ⅰ region

圖4示出不同質量分數(shù)乙醇誘導下獲得SF水凝膠的XRD譜圖?？梢钥闯?，所有樣品均在20.8°附近有1個顯著的特征衍射峰，為典型的silk II結構。此外，在9.1°和28.2°處均出現(xiàn)有特征衍射峰，代表著silk II結構，20.1°和24.5°處為silk I結構特征峰[1]。上述結果可知，隨著乙醇質量分數(shù)的增加，20.1°處的特征峰逐漸消失，這與紅外光譜、Raman結果較為吻合。綜上，經乙醇處理的水凝膠具有更為顯著的β-折疊構象特征，且結晶度顯著高于僅受乙酸誘導的水凝膠，這使分子具有更高的取向，分子間作用力顯著增強，對水凝膠的熱穩(wěn)定性與力學性能均會產生一定影響。

圖4 不同質量分數(shù)乙醇誘導絲素蛋白水凝膠的X射線衍射光譜圖Fig.4 XRD pattern of SF hydrogels with different mass fraction of alcohol

2.3 SF水凝膠的熱穩(wěn)定性能分析

圖5(a)示出不同質量分數(shù)乙醇誘導SF水凝膠的DSC曲線。

圖5 不同質量分數(shù)乙醇誘導絲素蛋白水凝膠的DSC和TG曲線Fig.5 DSC (a) and TG (b) curves of SF hydrogels prepared by different mass ratios of alcohol

結果表明，所有樣品均有2處明顯吸熱峰：一處在60～130 ℃之間，代表水凝膠內部殘留的自由水和結合水的蒸發(fā)；另一處吸熱峰在294 ℃附近，為絲素蛋白的分解峰，此時分解速率達到最大，絲素蛋白間側鏈和主鏈遭到破壞。有報道[28,38]顯示，由于絲素蛋白內的部分無規(guī)卷曲和α-螺旋結構會隨溫度升高而轉變成更加穩(wěn)定的β-折疊結構，從而釋放熱量。實驗發(fā)現(xiàn)在絲素蛋白分解前沒有出現(xiàn)明顯的放熱峰，說明此時水凝膠樣品內部以β-折疊結構為主。圖5(b)示出不同質量分數(shù)乙醇誘導SF水凝膠的TGA曲線?？梢钥闯?，所有樣品也均存在2個質量損失階段：第1階段為40～170 ℃，在不含乙醇條件下SF水溶液形成的水凝膠內部的結合水含量最高，質量損失率約為11.41%；第2階段為220 ℃以后，當溫度達到400 ℃時，SF-0的殘?zhí)柯蕿?6.45%，隨著乙醇的增加，樣品的質量殘留量逐漸增大，當質量分數(shù)為10.0%時，殘?zhí)柯蔬_到49.05%。說明乙醇質量分數(shù)的增加促進了水凝膠熱穩(wěn)定性的增強，這與上述結果相吻合。

2.4 SF水凝膠的孔隙率和吸水率分析

孔隙率和吸水率是評價三維材料的一個重要指標，不僅受內部結構的影響，還與性能密切相關。本文計算出乙酸-乙醇誘導SF水凝膠的孔隙率和吸水率，當無乙醇加入時，SF-0水凝膠的孔隙率為(95.47±0.24)%， 隨著乙醇質量分數(shù)的升高，孔隙率沒有明顯變化，始終集中在95%附近，與SF-0樣品相近，說明乙醇的加入對水凝膠的孔隙率影響不大。SF-0、SF-1、SF-2.5、SF-5、SF-10樣品的吸水率分別為(2 040±108.5)%、(1 516±275.6)%、(2 367±333.3)%、(2 669±135.4)%、(2 286±672.6)%，說明隨著乙醇質量分數(shù)的增加，吸水率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，與水凝膠形貌(由片層結構轉化為纖維狀，并隨著乙醇質量分數(shù)增大纖維直徑逐漸增大)的變化趨勢相吻合，當乙醇質量分數(shù)為5.0%時吸水率最大。這可能由于此時水凝膠內部為纖維結構且直徑較小時，比表面積增大，更有利于水分子的吸附。

2.5 SF水凝膠的壓縮力學性能分析

選取SF-0和SF-5這2組樣品的力學性能進行對比，壓縮性能測試結果如圖6所示。由圖6(a)可以看出，干態(tài)下水凝膠的應力-應變曲線大致可分為3個階段，分別為低應變下的線性彈性區(qū)間(大概在0%～15%范圍內)，中等應變下的非線性塑性變形平臺(15%～45%)以及高應變下應力急劇增加區(qū)(45%以上)[31]。相較于SF-0水凝膠，SF-5水凝膠的壓縮強度有了顯著的提高，當壓縮應變?yōu)?0%時，SF-5水凝膠的壓縮強度可達到(75.16±3.79) kPa，而SF-0水凝膠的壓縮強度僅為(50.76±5.21) kPa，相較于以前通過其他制備工藝獲得的純SF纖維結構水凝膠((31.9±2.6) kPa[35])，有了顯著提高。在壓縮應變達到20%之前，SF-0水凝膠的壓縮強度明顯高于SF-5水凝膠，但SF-5水凝膠的線性彈性區(qū)間(0%～30%)明顯長于SF-0水凝膠(0%～15%)， 說明在壓縮應變從0%到30%的過程中，SF-5水凝膠內部可能再分為2個階段：首先是0%～15%壓縮應變階段，水凝膠內部纖維支架的壓縮起到一定的緩沖作用，故此階段上升趨勢較緩；當壓縮應變超過15%時，SF分子鏈開始伸長、舒展，因此，在15%～30%壓縮應變階段大致呈線性增長。從總體上來看，SF-5水凝膠的壓縮強度顯著高于SF-0水凝膠，原因大致有2個方面：一方面是結構上的差異，均勻的三維纖維支架能夠存儲和損耗較多的能量；另一方面，SF-5水凝膠內部結晶區(qū)所占比例較大(形成大量的β-折疊結構)，分子間形成緊密的氫鍵相互作用，進一步阻礙了分子鏈的斷裂、滑移。由圖6(b)可知，濕態(tài)條件下SF-5水凝膠的壓縮強度可達到(7.2±0.3) kPa，且經過5次反復的壓縮測試，水凝膠的回復率能夠達到伸長的63%，表明SF-5水凝膠具有良好的柔韌性。

圖6 干態(tài)和濕態(tài)條件下絲素蛋白水凝膠的壓縮性能Fig.6 Compressive property of SF hydrogels in dry and wet state. (a) Compressive property in dry state; (b) Cyclic compressive property in wet state

3 結 論

本文制備了一種形貌可控、性能穩(wěn)定的絲素蛋白(SF)水凝膠。通過改變SF溶液中乙醇的質量分數(shù)，探討并分析影響水凝膠形貌成形的因素，以及聚集態(tài)結構、熱穩(wěn)定性能、力學性能的變化情況。實驗發(fā)現(xiàn)，隨著乙醇質量分數(shù)的增加，SF溶液凝膠時間逐漸縮短，SF的無規(guī)卷曲構象進一步轉變成β-折疊構象；水凝膠形貌由均勻分布的孔洞結構逐漸向纖維結構轉變，且纖維化越趨明顯，當質量分數(shù)為5.0%時，纖維直徑達到(1.09±0.5) μm，如果乙醇的質量分數(shù)超過10.0%達到20.0%時，水凝膠凍干后將無法保持穩(wěn)定的立體骨架結構。此外，隨著乙醇的加入，水凝膠的力學性能也有所改善，在干態(tài)下應變?yōu)?0%時的壓縮強度從(50.76±5.21) kPa(乙醇的質量分數(shù)為0%)提高到(75.16±3.79) kPa(乙醇的質量分數(shù)為5.0%)，且在濕態(tài)下樣品的壓縮強度增加為(7.2±0.3) kPa，回復率達到伸長的63%，具有良好的強力和韌性。該絲素蛋白水凝膠可應用于組織支架、生物礦化等領域，具有一定的潛在價值。