崔啟璐， 李佳蔚， 潘柳桂， 楊 飛,3， 郁崇文

(1. 東華大學(xué) 紡織學(xué)院， 上海 201620； 2. 東華大學(xué) 紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實驗室，上海 201620； 3. 浙江金鷹股份有限公司， 浙江 舟山 316051)

黃酮類化合物廣泛存在于高等植物的根、莖、葉、花、果實中，是植物在長期自然選擇過程中產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物[1]，其不僅在植物的生長發(fā)育中起著重要作用，還具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛、抗衰老等功效[2]。研究表明羅布麻類纖維中存在黃酮類化合物，羅布麻纖維乙醇提取液中黃酮含量為0.09%時，其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有一定的抗菌性[3]，這說明黃酮類化合物是羅布麻纖維具有抗菌性的原因之一。在傳統(tǒng)脫膠工藝中，麻類纖維中的黃酮等有價值物質(zhì)會隨著預(yù)處理和脫膠過程而流失，大部分變成脫膠廢液，浪費(fèi)了寶貴的黃酮資源。

為充分提高麻類纖維的利用價值，在脫膠之前對麻纖維進(jìn)行黃酮萃取，不僅可獲得黃酮，還可起到麻纖維脫膠前預(yù)處理的作用，達(dá)到一步多用的效果。麻類纖維中提取黃酮類化合物的主要方法是溶劑法，大都使用乙醇和水的混合物[4]。為提高提取效率，學(xué)者們探索了采用微波[5]、超聲波[6]和酶[7]等協(xié)助溶劑萃取，也有將新型的超臨界流體技術(shù)應(yīng)用于黃酮萃取中[3]。黃春梅等[8]采用微波輔助法提取菜用黃麻葉中黃酮類化合物，得出當(dāng)萃取溫度為95 ℃, 提取時間為30 min,浴比為1∶60,微波電流為180 mA時，黃酮類化合物的提取率為1.77%。楊永濤[9]針對羅布麻，采用55%乙醇在提取溫度為50 ℃， 提取時間為25 min，浴比為1∶35，超聲波功率為400 W最佳工藝條件下，得到黃酮類化合物提取率為2.033%。陳如冰等[10]針對長蒴黃麻葉中黃酮的提取，得到較優(yōu)條件為溫度42 ℃，浴比1∶35，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取時間25 min，在此條件下長蒴黃麻葉中黃酮的提取率為2.577%。劉毅等[11]研究得出，提取大麻葉中黃酮的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶20，提取時間2.0 h，提取溫度70 ℃，在該最優(yōu)提取條件下，大麻葉總黃酮提取量為14.28 mg/g。

目前，針對經(jīng)過漚麻后的黃麻纖維中是否含有黃酮類化合物以及其含量的系統(tǒng)性研究較少，因此，本文使用水醇提取法，按照二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計方法制備了黃麻纖維提取液，并對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為黃麻纖維中黃酮類化合物的充分利用以及提高黃麻纖維附加值提供一定的參考。

1 試驗部分

1.1 試驗材料與儀器

材料：黃麻韌皮部纖維，經(jīng)過漚麻處理，湘南麻業(yè)有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，合肥博美生物科技有限公司；無水乙醇(CH3CH2OH)、三氯化鋁(AlCl3)，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；去離子水，自制。

儀器：YP1002N型電子天平，上海天美天平儀器有限公司；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；Labconco2.5L型真空冷凍干燥機(jī)，美國LABCONCO公司；JSM-5600LV型掃描電子顯微鏡(SEM)， 日本JEOL公司；IE 300 X型能譜儀(EDS)， 英國Oxford公司；Lambda 35型紫外-可見近紅外分光光度計、Spectrum Two型傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)、DSC-4000型差示掃描熱量儀(DSC)、 TGA-4000型熱重分析儀(TGA)，均為美國PerkinElmer公司。

1.2 黃酮類化合物提取

為探討乙醇體積分?jǐn)?shù)、浴比以及提取時間對黃麻纖維中黃酮類化合物提取效果的影響，采用二次通用旋轉(zhuǎn)方法設(shè)計試驗。具體操作步驟為：將配制的乙醇溶液置于圓底燒瓶中，放入精確稱量的5.0 g黃麻纖維，在不同試驗參數(shù)下經(jīng)索氏提取后得到黃麻提取液，待測；將剩余提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，經(jīng)真空冷凍干燥后，得到黃麻纖維提取物，備用。

1.3 黃酮總含量的測定

1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。參照文獻(xiàn)[3]中的方法進(jìn)行繪制。將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于120 ℃下干燥至質(zhì)量恒定，精確稱取0.01 g，溶解于60%的乙醇溶液中定容至100 mL，分別取1、2、3、4、5和6 mL，再加入5%的AlCl3溶液定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度分別為1、2、3、4、5和6 mg/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。搖勻靜置15 min 后，用紫外-可見近紅外分光光度計在波長為415 nm的可見光下測定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度。分別以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度和質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度-質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：

y= 23.809 5x-0.0214 3，R2=0.992 9

式中：x為吸光度；y為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)量濃度，mg/L。

2)黃麻提取液中黃酮含量的測定。將1 mL黃酮提取液置于10 mL容量瓶中定容，稀釋后測定吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算黃酮的質(zhì)量濃度，然后代入下式計算黃酮提取率。

式中：ye為黃酮提取率，%；V為黃酮提取液的體積，mL；m為黃麻纖維質(zhì)量，mg。

1.4 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計

二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計方法試驗次數(shù)少，計算過程簡單，可部分消除回歸系數(shù)間的相關(guān)性，且二次設(shè)計具有旋轉(zhuǎn)性，減小了試驗誤差，試驗結(jié)果具有較強(qiáng)的代表性[12]，因此，本文選用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計方法進(jìn)行提取工藝優(yōu)化試驗。根據(jù)前期單因素試驗探索結(jié)果，選用乙醇體積分?jǐn)?shù)x1(%)、浴比x2、提取時間x3(min) 為因子，以±γ、±1、0為水平，以黃酮提取率為指標(biāo)，進(jìn)行三因子的二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計，試驗因子水平編碼表見表1。

1.5 黃麻纖維提取物的結(jié)構(gòu)和性能測試

對經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和真空冷凍干燥的黃麻纖維提取物進(jìn)行測試，用以鑒定黃麻纖維提取物中是否含有黃酮類化合物。

1.5.1 化學(xué)結(jié)構(gòu)測試

采用傅里葉紅外光譜儀測試充分干燥后樣品的化學(xué)結(jié)構(gòu)，掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為8 cm-1， 掃描次數(shù)為30。

1.5.2 表面形態(tài)觀察及表面元素測試

采用掃描電子顯微鏡測試噴金后樣品的表面形態(tài)，并采用配備的能譜儀對其表面元素組成進(jìn)行分析，加速電壓為5 kV。

1.5.3 熱性能測試

采用差示掃描量熱儀測試樣品的熱性能。測試樣品質(zhì)量為5～8 mg，以10 ℃/min的速率升溫至250 ℃，保溫3 min消除熱歷史，得到第1次升溫曲線；再以10 ℃/min的降溫速率降溫至-60 ℃，得到第1次降溫曲線；然后再以10 ℃/min的速率升溫至250 ℃，得到第2次升溫曲線。

采用熱重分析儀測試樣品的熱穩(wěn)定性。將5～8 mg 樣品置于坩堝中，在氮?dú)鈿夥罩幸?0 ℃/min的速率升溫，升溫范圍為30～700 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計試驗結(jié)果分析

根據(jù)三因子二次通用旋轉(zhuǎn)試驗設(shè)計的結(jié)構(gòu)矩陣表進(jìn)行試驗，利用紫外分光光度法測試提取液中黃酮類化合物含量，試驗設(shè)計方案及提取液中黃酮類化合物提取率如表2所示。

2.2 回歸方程的建立及求解

2.2.1 回歸方程系數(shù)的求解及顯著性檢驗

針對二次通用旋轉(zhuǎn)試驗方案及結(jié)果，采用Design Expert 8.0(DX8) 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行計算，建立指標(biāo)與工藝參數(shù)間的回歸方程?；貧w方程的模型為

對表2中的試驗參數(shù)及提取率結(jié)果進(jìn)行計算，得到回歸系數(shù)顯著性結(jié)果見表3。

2.2.2 回歸方程的顯著性檢驗結(jié)果分析

同時，對建立的回歸方程的顯著性進(jìn)行檢驗，結(jié)果見表4。僅當(dāng)F1Fα2時，才可認(rèn)為回歸方程在某一對顯著性水平下是顯著的。由表4可知，回歸方程的失擬值F1小于F0.01(5,5)，說明回歸方程模型失擬度不顯著；則回歸方程對響應(yīng)值影響的顯著性大小由回歸值F2來判定，F(xiàn)2越大回歸方程中變量影響的顯著程度越高。由表4可知，回歸方程的回歸值F2大于F0.25(9,10)， 說明回歸方程顯著。

2.2.3 回歸模型分析

建立有效的回歸方程并繪制其等高線圖。根據(jù)表3和表4的顯著性檢驗結(jié)果，剔除不顯著的系數(shù)，建立有效回歸方程為

y=0.013+0.006 855x1x3+0.004 458x2x3-

0.008 6x12+0.002 561x32

(3)

根據(jù)有效回歸方程繪制等高線，觀察各因子間的兩兩交互作用對提取率的影響如圖1所示。

由圖1(a)可知，浴比的變化對黃酮提取率的作用程度較小，乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響是先增大后減小。由圖1(b)可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢；隨著提取時間的延長，黃酮提取率逐漸減小且幅度較小。由圖1(c)可知，浴比對黃酮提取率的影響較小，隨著時間的增加，黃酮提取率逐漸減小。綜合分析可知，各因素的影響關(guān)系為：x1(乙醇體積分?jǐn)?shù))>x2(提取時間)>x3(浴比)。

2.2.4 優(yōu)化模型的建立及求解

通過計算得到回歸方程：

約束條件為：-1.682≤x1≤1.682，-1.682≤x2≤1.682，-1.682≤x3≤1.682。

采用隨機(jī)方向搜索法在MatLab 中運(yùn)算，根據(jù)隨機(jī)方向搜索的特點(diǎn)，選擇多次不同初始點(diǎn)進(jìn)行求解，尋找全局最優(yōu)值minf(x) 。選擇最優(yōu)解(f(x)=0.036 1)、較優(yōu)解1(f(x)=0.032 3)、較優(yōu)解2(f(x)=0.031 5)來分別進(jìn)行驗證，解碼結(jié)果如表5中預(yù)測值所示。

2.3 優(yōu)化工藝的驗證

為驗證最優(yōu)工藝的準(zhǔn)確性，根據(jù)2.2.4節(jié)計算結(jié)果，對最優(yōu)解、較優(yōu)解1和較優(yōu)解2重新進(jìn)行驗證提取，并從表2的通用旋轉(zhuǎn)試驗方案中選取4個性能較好的試驗結(jié)果(試驗號分別為8#、12#、14#、16#) 作為對照組，驗證結(jié)果見表5?？芍?，最優(yōu)解提取率的預(yù)測值和實測值均大于其他試驗結(jié)果，表明最優(yōu)工藝具有可靠性和有效性。選用最優(yōu)解即乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，浴比1∶50， 提取時間150 min為最優(yōu)提取工藝，此時提取率為0.037 0%，即370 mg/kg。盡管此工藝為最優(yōu)工藝，但與相關(guān)文獻(xiàn)相比，黃酮提取率還是相對較低，這可能是由于黃麻纖維中黃酮含量本身相對較少，且采用的黃麻纖維經(jīng)過了一定的漚麻處理，導(dǎo)致黃酮含量進(jìn)一步減少。

2.4 黃麻纖維提取物的結(jié)構(gòu)與性能分析

2.4.1 黃麻纖維提取物的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

采用傅里葉變換紅外光譜儀分別對黃麻纖維提取物和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測試，結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，黃麻纖維提取物在3 337 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，這與羥基特征吸收峰范圍(3 750～3 000 cm-1) 較為一致，可推測樣品化合物中可能含有羥基基團(tuán)，同時此處的峰強(qiáng)而寬，也有可能是來自于樣品內(nèi)存在不同程度的氫鍵作用；在2 918 和2 851 cm-1處附近的吸收峰屬于飽和C—H鍵伸縮振動峰，推測黃麻纖維提取物中含有 C—H 結(jié)構(gòu)；1 462 cm-1處的吸收峰說明樣品中含有—CH2基團(tuán)；在1 087 cm-1處的吸收峰可能是 C—O 伸縮振動引起的，這類吸收峰代表黃酮環(huán)上有醚鍵 C—O—C 和醇類的 C—O；801 cm-1處是黃酮分子中苯環(huán)上的 C—H面外彎曲振動峰；531 cm-1處是 O—H 面外彎曲振動峰[9]。圖中黃麻纖維提取物的紅外光譜與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的譜圖部分相似，可推測黃麻纖維提取物中可能含有蘆丁(槲皮素-3-O-蕓香糖苷)，或者蘆丁的衍生物成分[9]，這與相關(guān)文獻(xiàn)報道結(jié)果一致。

2.4.2 表面形態(tài)和能譜分析

黃麻纖維提取物的表面形態(tài)和元素含量測試結(jié)果如圖3和表6所示。

由圖3可知，黃麻纖維提取物表面結(jié)構(gòu)較為松散。由表6可知，黃麻纖維提取物中含有C元素(69.81%)、 O元素(24.87%)、Si元素(2.14%)、Cl元素(1.11%)，以及微量的Na、K和Ca元素。結(jié)果表明黃麻纖維提取物中含有較多雜質(zhì)，需要對黃麻纖維提取物進(jìn)行樹脂吸附等后續(xù)分離提純，才能得到較純的黃酮類化合物。

2.4.3 熱穩(wěn)定性分析

分別使用差示掃描熱量儀和熱重分析儀對黃麻纖維提取物進(jìn)行熱穩(wěn)定性分析，結(jié)果見圖4。

由圖4(b)可知，黃麻纖維提取物質(zhì)量損失的第1階段發(fā)生在81.4 ℃附近，質(zhì)量損失率為2.94%，這是黃麻纖維提取物中存在的水分在加熱時蒸發(fā)而引起的，這一階段對應(yīng)圖4(a)第1次升溫過程中，在76.4 ℃時出現(xiàn)的1個明顯的吸熱峰，由于這一部分是水分蒸發(fā)引起的，屬于不可逆過程，因此，在第 2次升溫中，該溫度下DSC曲線平穩(wěn)。質(zhì)量損失第2個階段是從150.6 ℃附近開始的，對應(yīng)圖5(a)中的放熱峰。該階段樣品慢慢氧化分解從而質(zhì)量下降，在338.2 ℃時質(zhì)量顯著降低；DTG曲線出現(xiàn)尖銳熱分解強(qiáng)峰，質(zhì)量損失率為31.64%。第3個質(zhì)量損失階段發(fā)生在338～500 ℃之間，并在488.6 ℃時DTG曲線出現(xiàn)1個較緩的質(zhì)量損失峰，可能是少量樣品部分揮發(fā)分解所致。第4個質(zhì)量損失階段從500 ℃開始，在550 ℃時出現(xiàn)1個平緩的放熱峰，隨后樣品質(zhì)量損失逐漸變緩，直到熱分解反應(yīng)結(jié)束。根據(jù)熱穩(wěn)定性測試結(jié)果，結(jié)合參考文獻(xiàn)[13]可知，黃麻纖維提取物中含有黃酮類化合物，且黃酮的熱穩(wěn)定性高于黃麻脫膠時的溫度(100 ℃左右)。

3 結(jié) 論

1)本文采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計方法，建立了黃酮提取率(y)與乙醇體積分?jǐn)?shù) (x1) 、浴比(x2)、提取時間(x3) 間關(guān)系的回歸方程為：y=0.013+0.006 855x1x3+0.004 458x2x3-0.008 6x12+ 0.002 561x32。

2)根據(jù)建立的有效回歸方程得到優(yōu)化工藝為: 乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、浴比1∶50、提取時間150 min，黃酮提取率可達(dá)到0.037 0%，并經(jīng)試驗驗證表明該回歸方程及其最優(yōu)參數(shù)的準(zhǔn)確性。

3)黃麻纖維提取物中含有黃酮類化合物。熱穩(wěn)定性測試結(jié)果表明，黃麻纖維提取物的熱分解可分為4個階段，與現(xiàn)有文獻(xiàn)研究中黃酮的熱分解性質(zhì)基本吻合，從另一個側(cè)面表明黃麻纖維中含有黃酮類化合物。