劉 輝，曾潔琳，梅 萍，高崧毅，趙子妍，劉 芳，楊安平

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院·廣東 佛山 528000)

金縷梅，別名木里香、牛踏果，為薔薇目、金縷梅科、金縷梅屬落葉灌木或小喬木，多分布于四川、湖北、安徽、浙江、江西、湖南及廣西等省區(qū)[1-2]。金縷梅，性味甘平，具有補(bǔ)中益氣的功效。研究表明，金縷梅內(nèi)含單寧質(zhì)、槲皮素、山奈酚等化學(xué)成分[3]。金縷梅具有抑菌[4]、調(diào)節(jié)皮脂分泌、鎮(zhèn)靜、安撫的作用，對(duì)龜裂、曬傷、粉刺也有治療作用[5]。

多酚類物質(zhì)在抗炎、抗氧化等諸多方面具有較好的活性[6]。迄今為止，未見有關(guān)金縷梅中多酚提取及其抗氧化、抑制酪氨酸酶作用方面的研究，由于多酚類物質(zhì)在高溫下很不穩(wěn)定，常規(guī)的回流提取效率較低，所以本文擬采用超聲法提取金縷梅總酚，考察乙醇濃度、超聲時(shí)間、液料比和提取次數(shù)對(duì)金縷梅總酚得率的影響，在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取條件，確定金縷梅總酚的最佳提取條件，以提取物的DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，并評(píng)價(jià)了其抑制酪氨酸酶的作用，以期為金縷梅進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑 金縷梅：亳州鍵安堂有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)：成都德思特生物技術(shù)有限公司。福林酚試劑、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、酪氨酸酶、二甲基亞砜、L-酪氨酸、碳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：上海麥克林生化科技有限公司；實(shí)驗(yàn)所用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備 YRE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；JJ224BC萬(wàn)分之一分析天平：常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海亞榮生化儀器廠；UV-2700紫外分光光度儀：日本島津公司；潔盟JP-040S超聲波儀：深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司。

2 方法

2.1 金縷梅總酚的提取 金縷梅置于烘箱中45 ℃烘干至恒重，粉碎后過(guò)60目篩，精密稱取金縷梅粉末2.0 g，置于250 mL具塞三角瓶中，并按一定液料比加入一定濃度的乙醇溶液。然后在室溫條件下進(jìn)行超聲提取，超聲功率為240 W，用超聲儀分別處理一定時(shí)間，取出后溶液立刻離心20 min(4 000 r/min)，取上清液，置于100 mL棕色容量瓶中，乙醇定容后測(cè)定總酚的含量。

2.2 樣品總酚含量測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照文獻(xiàn)[7]，采用福林-酚比色法。配制濃度為2、4、6、8、10 mg/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取上述各溶液0.1 mL，加入0.5 mL的福林酚試劑和7.9 mL的水，反應(yīng)5 min后，加1.5 mL的碳酸鈉溶液(1g/L)，避光放置2 h后于765 nm處測(cè)定吸光值。得回歸方程為y=0.077x+0.0074，R2=0.9997 (濃度范圍為2～10 mg/L)。金縷梅提取液按上述同樣方法處理，測(cè)定吸光值，根據(jù)回歸方程計(jì)算總酚含量，結(jié)果以每克金縷梅中含有相當(dāng)沒食子酸的毫克數(shù)來(lái)表示(mg/g)。

2.3 單因素對(duì)總酚得率的影響 精密稱取金縷梅粉末2.00 g，超聲功率400 W，按料液比加入不同濃度乙醇溶液、不同超聲時(shí)間和次數(shù)后，測(cè)定總酚含量。設(shè)定料液比1∶30 g/mL，超聲時(shí)間10 min，不同濃度的乙醇溶液(20%、35%、50%、65%)，提取時(shí)間為10 min；選擇50%乙醇溶液為溶劑，料液比1∶30 g/mL，置于不同提取次數(shù)(1、2、3、4次)提取10 min；提取次數(shù)為3次，溶劑為50%乙醇溶液，料液比1∶30 g/mL，分別提取不同時(shí)間(3、5、10、15 min)；提取次數(shù)為3次，按不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 g/mL)加入濃度為50%乙醇溶液，提取10 min。以金縷梅提取液中的總酚含量為考察指標(biāo)。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按L9(34)正交試驗(yàn)表對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，探討最佳提取工藝，因素水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

2.5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得到最優(yōu)超聲提取金縷梅總酚的工藝條件，按照此工藝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.6 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[8]方法并做適當(dāng)修改。金縷梅提取液減壓濃縮，得到金縷梅總酚提取物，配制成不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。配制濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液，以及濃度為1、2、3、4、5 g/L的樣品溶液與陽(yáng)性對(duì)照BHT溶液。精密移取0.1 mL不同濃度的樣品與BHT溶液，再分別加入4.9 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液，于暗處室溫反應(yīng)20 min，然后在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定金縷梅總酚及BHT的吸光度，根據(jù)下列公式計(jì)算清除率。實(shí)驗(yàn)平衡操作3次。A0為DPPH溶液+無(wú)水乙醇的吸光值；A1為DPPH溶液+樣品溶液的吸光值；A2為樣品溶液+無(wú)水乙醇的吸光值。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

2.7 ABTS自由基清除能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[9]方法并做適當(dāng)修改。將25 mL 7.0 mmol/L ABTS溶液與25 mL 2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液混合，于暗處反應(yīng)12～16 h，制備成ABTS溶液。用pH 7.4 10 mmol/L磷酸緩沖溶液將ABTS+·溶液稀釋，至其在波長(zhǎng)734 nm波長(zhǎng)處的吸收值為(0.7±0.002)。分別精密移取0.1 mL不同濃度的樣品和陽(yáng)性對(duì)照BHT溶液，分別加入3.9 mL ABTS溶液，混合搖勻，室溫條件下反應(yīng)6 min后，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值，按下列公式計(jì)算清除率。實(shí)驗(yàn)平衡操作3次。A空為ABTS溶液的吸光值；A樣為3.9 mL ABTS溶液+0.1 mL樣品溶液的吸光值。

ABTS的清除率(%)=[(A空-A樣)/A空]×100

2.8 酪氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[10]方法并做適當(dāng)修改。以10 mmol/L的L-酪氨酸為底物；配制濃度分別為0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5 g/L的金縷梅總酚和α-熊果苷陽(yáng)性對(duì)照溶液；磷酸鹽緩沖液為空白對(duì)照；將購(gòu)買的蘑菇酪氨酸酶配制成酶活力為100 U/mL的酶溶液。

按表2劑量精確移取a、b、c、四組樣液，置于37 ℃水浴中孵育10 min后，加入0.5 mL L-酪氨酸溶液，混勻，測(cè)得在475 nm處的吸光度Aa、Ab、Ac、Ad，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，然后按下面的公式計(jì)算提取液對(duì)絡(luò)氨酸酶的抑制率：

表2 抑制酪氨酸酶活性反應(yīng)液組成

酪氨酸酶抑制率(%)=[1-(Ad-Ac)/(Ab-Aa)]×100%

2.9 數(shù)據(jù)處理與分析 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用Minitab 17進(jìn)行分析，測(cè)定結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并采用Origin 9軟件作圖。

3 結(jié)果

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 乙醇濃度對(duì)金縷梅總酚提取量的影響 由圖1可見，隨著乙醇濃度的增加，金縷梅總酚的提取量先增加后下降，當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)，提取率達(dá)到最大值0.628 mg/g。

圖1 乙醇濃度對(duì)金縷梅總酚提取量的影響

3.1.2 超聲時(shí)間對(duì)金縷梅總酚提取量的影響 由圖2可見，金縷梅總酚的提取量在10 min時(shí)達(dá)到最大值0.752 mg/g。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)金縷梅總酚提取量的影響

3.1.3 料液比對(duì)金縷梅總酚提取量的影響 由圖3可見，在液料比為1∶10～1∶30(g/mL)之間時(shí)，金縷梅總酚的提取量逐漸增大，這可能是隨著溶劑的增加，酚類物質(zhì)的溶出逐漸增加，并在1∶30(g/mL)時(shí)達(dá)到最大值0.964 mg/g。

圖3 料液比對(duì)金縷梅總酚提取量的影響

3.1.4 提取次數(shù)對(duì)金縷梅總酚提取量的影響 由圖4可見，隨著提取次數(shù)的逐漸增加，多酚的提取量也隨之增加，但是提取3次后隨著提取次數(shù)的增加酚類的提取量增加程度已經(jīng)下降。考慮到提取時(shí)間、溶劑損耗及后續(xù)溶劑濃縮的能耗等因素，選擇提取次數(shù)為3次。

圖4 提取次數(shù)對(duì)金縷梅總酚提取量的影響

3.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 正交實(shí)驗(yàn)與方差分析結(jié)果見表3、表4。從表3的K值可以確定超聲輔助提取金縷梅總酚的最優(yōu)條件是A3B2C3D3，即乙醇濃度65%、超聲時(shí)間10 min、液料比1∶40 g/mL，提取次數(shù)4次。通過(guò)比較極差大小可知4個(gè)因素對(duì)金縷梅總酚的影響次序?yàn)椋篊(料液比)>D(提取次數(shù))>A(乙醇濃度)>B(超聲時(shí)間)。通過(guò)方差分析結(jié)果可知，A(乙醇濃度)、B(超聲時(shí)間)、C(料液比)和D(提取次數(shù))對(duì)金縷梅的總酚提取率均具有顯著影響。通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可知，在此最佳提取工藝條件下金縷梅總酚的提取量為(0.95±0.03) mg/g。由此工藝條件得到的總酚得率與正交實(shí)驗(yàn)7號(hào)(A3B1C3D2)工藝條件下總酚得率較為接近，在實(shí)際應(yīng)用中綜合考慮提取效率、時(shí)間成本、回收溶劑過(guò)程中能源損耗等因素，確定較優(yōu)工藝為A3B1C3D2，即乙醇濃度65%、超聲時(shí)間5 min、液料比1∶40 g/mL，提取次數(shù)3次。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

3.3 抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 DPPH自由基的清除能力 見圖5。金縷梅總酚對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力，IC50為644.2 mg/L,陽(yáng)性對(duì)照BHT清除DPPH自由基的IC50為301.6 mg/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金縷梅總酚具備一定的清除DPPH自由基能力。

圖5 金縷梅總酚對(duì)DPPH自由基的清除效果

R2=0.9999 (調(diào)整R2=0.9998)

3.3.2 ABTS自由基的清除能力 見圖6。金縷梅總酚清除ABTS自由基的IC50為157.8 mg/L。陽(yáng)性對(duì)照BHT清除ABTS自由基的IC50為279.2 mg/L。金縷梅總酚清除ABTS的作用明顯好于BHT。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金縷梅總酚具備良好的清除ABTS自由基能力。

圖6 金縷梅總酚對(duì)ABTS自由基的清除效果

3.4 酪氨酸酶抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果 抑制酪氨酸酶活性結(jié)果見圖7。在濃度低于0.625 g/L時(shí)，金縷梅總酚抑制酪氨酸酶活性明顯高于陽(yáng)性對(duì)照α-熊果苷。當(dāng)濃度高于0.625 g/L時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照抑制酪氨酸酶作用明顯強(qiáng)于金縷梅總酚。金縷梅總酚與陽(yáng)性對(duì)照α-熊果苷抑制酪氨酸的IC50值分別為0.597 g/L和0.6454 g/L。上述結(jié)果表明，金縷梅總酚具有較好的抑制酪氨酸酶活性。

圖7 金縷梅總酚對(duì)絡(luò)氨酸酶的抑制作用

4 討論

本文采用超聲輔助法對(duì)金縷梅總酚進(jìn)行了提取，在單因素的實(shí)驗(yàn)條件下探索了乙醇濃度、超聲時(shí)間、液料比和提取次數(shù)4個(gè)相關(guān)因素對(duì)金縷梅多酚提取量的影響，并用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)金縷梅多酚的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳工藝為：即乙醇濃度65%、超聲時(shí)間5 min、液料比1∶40 g/mL，提取次數(shù)3次，在此條件下金縷梅總酚提取量為0.934 mg/g。在單因素實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)乙醇濃度大于50%時(shí)提取率降低的原因可能是由于隨著乙醇濃度的增加，溶液極性也隨之增加，根據(jù)相似相溶原理，此時(shí)不利于酚類物質(zhì)的溶解[11]。當(dāng)超聲時(shí)間在10 min以內(nèi)時(shí)，對(duì)細(xì)胞的破碎程度逐漸增加，導(dǎo)致酚類的提取量逐漸增大，10 min時(shí)細(xì)胞的破碎程度達(dá)到最大[12]。10 min后隨著時(shí)間增加提取率下降的原因可能是由于超聲導(dǎo)致溶液溫度提高，破壞了多酚結(jié)構(gòu)，使多酚類物質(zhì)發(fā)生降解。正交實(shí)驗(yàn)極差分析表明，4個(gè)因素對(duì)總酚總酚提取量的影響次序?yàn)椋毫弦罕?提取次數(shù)>乙醇濃度>超聲時(shí)間。方差分析結(jié)果也表明，4個(gè)因素均可顯著性影響金縷梅總酚的提取率。從上述結(jié)果看出，最佳工藝選擇與單因素分析結(jié)果具有一定差別，原因?yàn)閱我蛩貙?shí)驗(yàn)確定的最佳條件是局部最優(yōu)條件，而正交實(shí)驗(yàn)確定的綜合各因素下的最佳工藝條件，最后還要根據(jù)在實(shí)際應(yīng)用中提取效率、時(shí)間成本、回收溶劑過(guò)程中能源損耗等因素來(lái)確定最終工藝條件。多酚類是發(fā)揮抗氧化作用的常見成分。DPPH法和ABTS法是檢測(cè)抗氧化能力的常用方法[13-14]，本文采用上述兩種方法對(duì)金縷梅總酚的抗氧化能力進(jìn)行了檢測(cè)。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，金縷梅總酚對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基均具有明顯的清除作用，對(duì)ABTS自由基的清除作用好于BHT。酪氨酸酶又稱多酚氧化酶，在黑色素生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。通過(guò)抑制酪氨酸酶活性，可有效減少黑色素的生成，提高皮膚的白皙度[15-16]。本文對(duì)金縷梅總酚抑制酪氨酸酶作用進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，金縷梅總酚具有較強(qiáng)的抑制酪氨酸酶作用，在一定濃度范圍內(nèi)強(qiáng)于α-熊果苷。由此可見，金縷梅在抗氧化及抑制酪氨酸酶活性方面均具有較好的功效。本文的研究結(jié)果將為金縷梅的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。