霍金海，程 團(tuán)，孫國東，劉 政，王偉明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·黑龍江 哈爾濱 150036)

北青龍衣為胡桃科植物核桃楸(JuglansmandshuricaMaxim)的未成熟果實(shí)外果皮[1]，被2001年版《黑龍江省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》收載[2]；具有抗癌、定痛之功效，用于治療各種癌癥和胃脘痛癥[3]。目前研究證實(shí)其具有良好的增強(qiáng)免疫系統(tǒng)活性[4]、減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激[5]、組織修復(fù)[6]、抑制癌細(xì)胞生長[7-10]等作用。隨著北青龍衣抗腫瘤作用的證實(shí)，其毒性問題也受到重視。研究證實(shí)其毒性成分主要分布于脂溶性部位，如醇提物、乙酸乙酯萃取物等[11-13]，多為胡桃醌(5-羥基-1,4-萘醌)等萘醌類成分。該部位成分展現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性但也暴露出較強(qiáng)的神經(jīng)毒性及刺激性[14-16]。本研究采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)探究北青龍衣在大鼠心肌組織中的成分分布，為進(jìn)一步揭示其成分分布特點(diǎn)、進(jìn)一步進(jìn)行毒性研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 10周齡SPF級Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量270～300 g，由北京通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2016-0011。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于室溫(23±2)℃、濕度(60±10)%鼠房，12 h晝夜循環(huán)光照、大鼠可自由飲水及進(jìn)食普通飼料。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑 北青龍衣于2016年6 月采自哈爾濱市方正縣(128°92′62.1″E，45°62′82.8″N)，經(jīng)王偉明研究員鑒定為胡桃屬植物核桃楸(JuglansmandshuricaMaxim)的果實(shí)。將果實(shí)外表皮置于通風(fēng)處陰干，作為供試藥物。甲醇、乙腈：色譜級，德國默克；甲酸：色譜級，美國賽默飛；蒸餾水：廣州屈臣氏。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 AB UPLC型超高壓液相色譜、AB 5600+型高分辨質(zhì)譜儀：CIEX，美國；CM-12J型氮?dú)獯蹈蓹C(jī)：成萌偉業(yè)，中國北京；DW-86L959型冰箱：海爾，中國山東青島；Legend Micro 17R型低溫高速離心機(jī)：賽默飛世爾，美國；BP211D型電子天平：賽多利斯，德國。軟件Analyst TF 1.7.1、PeakView 2.0、masterview1.0、Metabolitepilot1.5：SCIEX，美國。

2 方法

2.1 樣品溶液的制備 提取物制備：取原藥350 g，75%乙醇2 800 mL超聲提取2次，每次60 min，2次提取液合并后旋蒸至密度1.30，減壓干燥即得。灌胃藥液的制備：參考藥材標(biāo)準(zhǔn)擬定北青龍衣單日服用劑量為30 g[2]，按照70 kg成人10倍量進(jìn)行換算，將乙醇提取物配制成1.35 g/mL溶液備用。

2.2 心肌組織制備 實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分成空白、給藥兩組，自由飲水，禁食12 h。空白組稱重后以20 mL/kg灌胃蒸餾水，給藥組同法灌給2.1制備的藥液。給藥后0.5 h，麻醉大鼠并采集心臟，置于-80 ℃冰箱備用。剪取200 mg大鼠心肌組織于EP管內(nèi)，取雙蒸水1 000 μL勻漿，加入4倍量乙腈，2 500 r渦旋60 s，低溫超聲120 s后4 ℃靜置10 min，精密轉(zhuǎn)移上清液2 000 μL，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，定量取上清液1 200μL，氮吹干后以80%甲醇250μL復(fù)溶，2 500 r渦旋60 s，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)樣。

2.3 色譜條件 Acquity UPLC BEH系列色譜柱，BEH C18預(yù)柱(5 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)，(美國Waters)，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫35 ℃。洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表

2.4 質(zhì)譜條件 使用Analyst TF 1.7.1 進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集。以電噴霧電離源、N2作為霧化氣，采用正、負(fù)離子掃描方式，對響應(yīng)值超過100 cps的8個最高峰進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，開啟扣除背景(DBS)。質(zhì)譜條件見表2。

表2 質(zhì)譜條件表

2.5 數(shù)據(jù)分析方法 原型成分：數(shù)據(jù)導(dǎo)入Peakview2. 0內(nèi)嵌軟件Masterview中，Confidence setting(信任設(shè)定)為Mass Errorr<5；權(quán)重30%，Isotope<10%；權(quán)重40%，F(xiàn)ormula Finderscore>70%；權(quán)重40%，選擇RT Error%for RT Score。排除共有成分，結(jié)合保留時間、精確質(zhì)量數(shù)、誤差值以及碎片離子對數(shù)據(jù)綜合研判。代謝產(chǎn)物：利用MetabolitePilot1.5，將體外數(shù)據(jù)庫化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式以及二級圖譜導(dǎo)入；依據(jù)代謝參數(shù)、選擇最高概率會發(fā)生的兩條代謝路徑，選擇Peak Finding Strategy、Generic Parameters、Compound-Specific Parameters；導(dǎo)入兩組數(shù)據(jù)并分為“sample”和“model”，綜合分析推斷得到代謝產(chǎn)物。

3 結(jié)果

3.1 UPLC-Q-TOF/MS的采集 利用2.3及2.4項(xiàng)下已建立色譜質(zhì)譜條件對樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，結(jié)果見圖1。

圖1 正、負(fù)離子模式下的總離子流色譜圖(A: ESI+；B：ESI-)

3.2 心肌組織北青龍衣成分分布 對采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，鑒別得到31個化合物，包括原型成分22個和代謝產(chǎn)物9個，其中萘醌類化合物18個，二芳基庚烷類7個，三萜類3個，黃酮類化合物2個以及酚酸類1個。結(jié)果見表3。

北青龍衣代表性化合物為萘醌類，其質(zhì)譜裂解一般遵循H2O和CO的接連丟失。以所鑒別的13號化合物胡桃醌裂解途徑為例，準(zhǔn)分子離子175[M+H]+豐度高，易丟失一個H2O形成157[M+H-H2O]+碎片離子，隨后的高能碰撞造成CO的連續(xù)丟失，129[M+H-H2O-CO]+、101[M+H-H2O-2CO]+相繼出現(xiàn)。而與此同時，準(zhǔn)分子離子也會在離子源的轟擊下首先失去CO碎片致使147[M+H-CO]+離子形成，接連的CO丟失誘使開環(huán)反應(yīng)出現(xiàn)133[M+H-CO-CH2]+、121[M+H-CO-C2H2]+兩個碎片離子出現(xiàn)。并且通過與胡桃醌對照品的二級圖譜進(jìn)行比較，綜合判斷13為胡桃醌，通過結(jié)合二級碎片離子預(yù)測可能裂解形式，見圖2、圖3。

圖2 化合物13二級質(zhì)譜圖及對照品比對鏡像圖

圖3 化合物1結(jié)構(gòu)解析圖

表3 大鼠心肌組織北青龍衣成分分布

續(xù)表3 大鼠心肌組織北青龍衣成分分布

續(xù)表3 大鼠心肌組織北青龍衣成分分布

4 討論

首先，本課題組對1、5、10倍臨床劑量對北青龍衣成分的檢出進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)10倍給藥量的心肌組織響應(yīng)強(qiáng)度大且離子數(shù)最多。因此選定10倍給藥量為考察劑量。其次，對時間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行了考察，通過對0.5、1、2、3、4 h 5個節(jié)點(diǎn)心肌成分譜圖豐度以及離子強(qiáng)度的研究，最終采用效果最理想的0.5 h作為時間節(jié)點(diǎn)。再次，通過4倍量甲醇、乙腈、甲醇：乙腈(1∶1)及乙酸乙酯對去除組織蛋白試劑考察，發(fā)現(xiàn)去除雜質(zhì)較好的為乙腈，檢測到的成分多、峰強(qiáng)大，故而確定乙腈法為樣本預(yù)處理方法，確定響應(yīng)值較大與離子數(shù)最多的乙腈法做為處理方法。

通過一系列的研究，自大鼠心臟組織中共鑒定出萘醌18個，二芳基庚烷7個，2個黃酮類，三萜3個以及1個酚酸，共計(jì)22個原型成分和9個代謝產(chǎn)物在內(nèi)的31種成分?；究梢耘袛啾鼻帻堃碌妮刘?、二芳基庚烷類為主要的入心臟成分，為下一步其對心臟毒性的研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)，豐富了北青龍衣的基礎(chǔ)研究。