許岡躍，陳 驊

(中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)海警總隊(duì)醫(yī)院外三科·浙江 嘉興 314000)

燒傷發(fā)生率居外傷疾病譜第4位，具有較高的致殘、致死率。根據(jù)燒傷程度及深度可分為I度、淺II度、深I(lǐng)I度和III度燒傷，臨床上深I(lǐng)I度燒傷最為常見(jiàn)且治療結(jié)局變數(shù)較大,促進(jìn)皮膚燒傷創(chuàng)面愈合是燒傷治療的關(guān)鍵。病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面局部氧供不足而誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)是影響創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵因素[1-2]。芹菜素(apigenin，APG)是廣泛存在于蔬菜和水果中的一種黃酮類化合物，以芹菜中含量最高，具有良好的抗氧化、抗炎、抗凋亡活性[3-5]。本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)制備深I(lǐng)I度燒傷大鼠模型，觀察APG對(duì)深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面愈合的影響并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 150只SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，7 周齡，體質(zhì)量200～240 g，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(冀)2018-004。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境：室溫(25±1)℃、相對(duì)濕度(60±5)%、光照黑暗各12 h交替。

1.2 藥物與主要試劑 APG：陜西慧科植物開(kāi)發(fā)有限公司，純度≥98%，加二甲基亞砜溶解后通過(guò)生理鹽水定容，制備濃度6.25、12.50、25.00 g/L的芹菜素溶液；乳酸鈉林格注射液：石家莊四藥有限公司。羥脯氨酸(HYP)試劑盒：南京建成生物工程研究所；表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞因子(b-FGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)抗體和DAB顯色試劑盒：北京博奧森生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 YLS-5Q型燙傷儀：天津科技發(fā)展有限公司；TDL-80-2B型臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；UV2100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器有限公司； VE180型小型電泳槽、VE186型轉(zhuǎn)膜槽：上海天能科技有限公司；CFX型凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、模型制備與給藥 將150只大鼠進(jìn)行數(shù)字編碼后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假燒傷組，模型組，APG低、中、高劑量[10、20、40 mg/(kg·d)]組，各30只；實(shí)驗(yàn)前12 h禁食禁水。深I(lǐng)I度燒傷大鼠模型制備[6]：實(shí)施麻醉，剃除背部毛發(fā)后通過(guò)硫化鈉溶液(濃度8%)脫毛，根據(jù)公式S=K·W2/3[S為體表面積(cm2)、W為體質(zhì)量(g)、K=0.091]計(jì)算體表面積[7]；假燒傷組大鼠脫毛后即腹腔注射5 mL乳酸鈉林格溶液，其余各組大鼠通過(guò)燙傷儀于背部脫毛處皮膚加壓0.03 MPa、溫度106 ℃持續(xù)5 s制備深I(lǐng)I 度30%燒傷大鼠模型，然后立即腹腔注射5 mL乳酸鈉林格溶液以抗休克。造模結(jié)局判斷：皮膚創(chuàng)面組織病理切片，部分真皮層內(nèi)細(xì)胞壞死、部分毛囊、汗腺等附件結(jié)構(gòu)完整，即可判定造模成功。造模完成后，APG低、中、高劑量組分別腹腔注射濃度6.25、12.50、25.00 g/L的芹菜素溶液(注射劑量2 mL/kg)，假燒傷組和模型組大鼠2 mL/kg同步給予生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥14 d。

2.2 觀察指標(biāo)及測(cè)定

2.2.1 燒傷創(chuàng)面恢復(fù)狀況觀察、愈合率檢測(cè)及含水量計(jì)算 各組按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)取10只大鼠，觀察各組大鼠皮膚創(chuàng)面恢復(fù)狀況，包括皮膚顏色、毛發(fā)生長(zhǎng)狀況、結(jié)痂狀況、滲出液量等。分別于第0天、第14天對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行拍照，通過(guò)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算創(chuàng)面面積，創(chuàng)面愈合率(%)=(1-未愈創(chuàng)面面積/初始創(chuàng)面面積)×100%。頸椎脫臼處死大鼠后，取皮膚創(chuàng)面組織，生理鹽水沖洗并拭干后稱重(W1)，置95 ℃烤箱烘烤至恒重后稱重(W2)，含水量(%)= [(W1- W2)/W1]×100%

2.2.2 創(chuàng)面組織HYP含量檢測(cè) 分別取各組剩余的10只大鼠，頸椎脫臼處死后取皮膚創(chuàng)面組織，剪碎、加入9倍量4 ℃裂解液后研磨勻漿，4 ℃、3 500 r/min離心10 min后取上清液，按照各試劑盒操作說(shuō)明，通過(guò)紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)HYP含量。

2.2.3 創(chuàng)面組織EGF、b-FGF、VEGF蛋白表達(dá)檢測(cè) Western blot檢測(cè)。取各組大鼠創(chuàng)面組織勻漿液，4 ℃、12 000 r/min離心20 min后取上清液，BCA法檢測(cè)樣品蛋白濃度后95 ℃水浴10 min使蛋白變性，取30 μg蛋白量行SDS-PAGE電泳使蛋白分離、轉(zhuǎn)PVDF膜、5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h后滴加EGF、b-FGF、VEGF、β-actin一抗后4℃孵育過(guò)夜，洗膜后滴加二抗室溫孵育1 h，洗膜后滴加DAB顯色，以β-actin為內(nèi)參，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)以條帶灰度值半定量目標(biāo)蛋白表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 APG對(duì)深I(lǐng)I度燒傷大鼠創(chuàng)面恢復(fù)的影響 假燒傷組大鼠創(chuàng)面呈正常皮膚顏色、毛發(fā)生長(zhǎng)茂密。模型組創(chuàng)面結(jié)痂厚度不均、少部分脫落，可見(jiàn)黃色液體滲出，可見(jiàn)少量新生肉芽。與模型組比較，APG低、中、高劑量組創(chuàng)面面積減小、大部分結(jié)痂脫落、新愈合皮膚紅潤(rùn)、創(chuàng)面區(qū)域毛發(fā)開(kāi)始生長(zhǎng)、液體滲出量減少。APG高劑量組新愈合皮膚較紅潤(rùn)且彈性較好、毛發(fā)生長(zhǎng)較茂密、未見(jiàn)液體滲出，效果優(yōu)于其它組。

3.2 APG對(duì)深I(lǐng)I度燒傷大鼠創(chuàng)面愈合率和含水量的影響 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合率和含水量的比較

3.3 APG對(duì)深I(lǐng)I度燒傷大鼠創(chuàng)面組織HYP含量的影響 見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠創(chuàng)面組織HYP含量的比較

3.4 APG對(duì)深I(lǐng)I度燒傷大鼠創(chuàng)面組織EGF、b-FGF、VEGF蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)圖1，表3。

A.假燒傷組；B.模型組；C.APG低劑量組；D.APG中劑量組；E.APG高劑量組圖1 各組大鼠創(chuàng)面組織EGF、b-FGF、VEGF蛋白表達(dá)的Western blot 檢測(cè)結(jié)果

表3 各組大鼠創(chuàng)面組織EGF、b-FGF、VEGF蛋白表達(dá)的比較

與假燒傷組比較，模型組大鼠創(chuàng)面組織EGF、b-FGF、VEGF蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，APG低、中、高劑量組EGF、VEGF蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)，其中APG中、高劑量組b-FGF蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)。

4 討論

皮膚是最易受燒傷損害的體表組織，根據(jù)“三度四分法”分級(jí)，臨床上以深I(lǐng)I度燒傷較為多見(jiàn)，其燒傷深度達(dá)真皮網(wǎng)層，但仍有部分真皮組織及毛囊、汗腺等皮膚附件存活，燒傷創(chuàng)面處理不當(dāng)可能誘發(fā)感染，導(dǎo)致創(chuàng)面加深、遷延不愈，增加治療難度甚至致死，因此良好的創(chuàng)面治療效果是提高深I(lǐng)I度燒傷患者預(yù)后的關(guān)鍵[8-10]。

黃酮類化合物能夠通過(guò)抑制燒傷創(chuàng)面滲出物而促進(jìn)創(chuàng)面愈合[11]。APG是天然存在的一種黃酮類化合物，以芹菜中含量最高。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)APG給藥14 d能夠有效促進(jìn)大鼠創(chuàng)面皮膚、毛發(fā)新生，保護(hù)毛囊、汗腺等皮膚附件，減少滲出液體量；提高創(chuàng)面愈合率，改善創(chuàng)面組織病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；提示APG具有促進(jìn)深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面愈合的作用。

HYP是膠原含量檢測(cè)的標(biāo)志物，創(chuàng)面組織HYP水平能夠反映創(chuàng)面愈合狀況[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)APG給藥14 d能夠有效降低創(chuàng)面組織含水量并提高HYP水平，也說(shuō)明APG具有促進(jìn)深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面愈合的作用。

EGF和b-FGF是兩種多肽類物質(zhì)，其中EGF具有促進(jìn)表皮角質(zhì)細(xì)胞和纖維細(xì)胞增殖和分化、促進(jìn)血管新生作用[13-15]；b-FGF具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移作用[16]；衛(wèi)昊等[17]研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)EGF、b-FGF表達(dá)能夠明顯促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合。VEGF具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用，進(jìn)而促進(jìn)血管新生[18-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)APG給藥14 d能夠明顯上調(diào)創(chuàng)面組織EGF、b-FGF、VEGF蛋白表達(dá)。

綜上所述，APG具有促進(jìn)深I(lǐng)I度燒傷大鼠創(chuàng)面愈合的作用，作用機(jī)制可能與上調(diào)EGF、b-FGF、VEGF蛋白表達(dá)有關(guān)。