耿海波，師明川，付世騫，安麗平

1.石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與藥品工程系，石家莊 050081

2.河北省地礦局第六地質(zhì)大隊(duì)，石家莊 050085

3.河北中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，石家莊 050200

4.河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050200

0 引言

微生物在生物圈中起著重要的作用，特別是在元素的生物轉(zhuǎn)化和生物地球化學(xué)循環(huán)、金屬和礦物轉(zhuǎn)化、分解、生物風(fēng)化、土壤和沉積物形成等領(lǐng)域。金屬—礦物—微生物三者之間的相互作用可以被認(rèn)為是地質(zhì)微生物學(xué)框架內(nèi)的一個(gè)重要課題，它可以簡單地定義為微生物在地質(zhì)過程中的作用，此類地質(zhì)微生物過程的核心是金屬和礦物轉(zhuǎn)化。微生物具有多種特性，可以影響金屬形態(tài)、流動(dòng)性、礦物形成或礦物溶解等變化，這種機(jī)制是金屬的天然生物地球化學(xué)循環(huán)的重要組成部分[1-2]。

層間氧化帶砂巖型鈾礦因其礦量大、開發(fā)成本低、對環(huán)境污染小、產(chǎn)出效益高的特點(diǎn),成為近些年國際上最有發(fā)展前景和市場競爭力的鈾礦類型，也是我國鈾礦勘查和開發(fā)的重點(diǎn)對象[3]。國內(nèi)外對此類鈾礦研究時(shí)發(fā)現(xiàn)微生物在成礦過程中扮演著重要的作用，Woolfolket al.[4]在1962年的研究表明，Micrococcus lactilyticus(Veillonella alcalescens)在厭氧的條件下利用氫做電子供體發(fā)生反應(yīng)，可將U（Ⅵ）還原為U（Ⅳ），美國學(xué)者Lovleyet al.[5-6]團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)硫酸鹽還原菌（SRB）和鐵還原菌可以將U（Ⅵ）還原為U（Ⅳ）并從中獲取能量。Abdelouaset al.[7]的研究發(fā)現(xiàn)Shewanella putrefaciens同樣對鈾具有還原作用，史維浚[8]在1989年的研究表明好氧的硫鐵桿菌能將FeS2氧化Fe（Ⅲ），進(jìn)而又促進(jìn)了Fe（Ⅲ）對U（Ⅳ）的氧化作用,使鈾發(fā)生強(qiáng)烈的水遷移。在此基礎(chǔ)上的研究重點(diǎn)主要集中在利用SRB對金屬的還原能力進(jìn)行污水治理和尾礦的生物修復(fù)等方面[9-10]。國內(nèi)對于鈾礦的微生物成礦作用研究主要集中在新疆十紅灘砂巖型鈾礦床，西北大學(xué)黃建新[11-13]團(tuán)隊(duì)研究表明礦床圍巖和地下水中賦含SRB、氧化硫桿菌、鐵細(xì)菌、硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌等多種微生物，并在成礦中扮演不同的角色。核工業(yè)203研究所喬海明[14-15]結(jié)合礦床水文地質(zhì)條件的研究證明微生物的分布和數(shù)量具有明顯的球生物化學(xué)分帶性。前人對于鄂爾多斯北部東勝鈾礦的研究表明鈾礦石中具有微化石[16]，礦石中脂肪酸的研究也間接證明了生物參與了成礦過程[17]，直羅組同生沉積建造水承擔(dān)了鈾成礦的主要流體，是微生物參與成礦的環(huán)境因素[18]。

本研究團(tuán)隊(duì)前期對東勝不同礦區(qū)的研究中分離得到了多種好氧和厭氧微生物，本文主要對東勝鈾礦中賦存的SRB分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并在國內(nèi)首次通過模擬實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)菌在東勝鈾礦成礦過程中的作用機(jī)制，為生物找礦和鈾污染治理提供參考。

1 地質(zhì)背景

東勝地區(qū)砂巖型鈾礦賦存于侏羅系直羅組，分為上、下兩個(gè)巖性段，它們在沉積時(shí)處于兩種截然不同的沉積環(huán)境，其中下段上部為灰綠色泥巖和灰綠色砂巖，下部為灰色中砂巖,是主要鈾礦化層位，控礦地層是多期辮狀河砂體；直羅組上段為泥巖、紫紅色細(xì)砂巖和灰綠色砂巖，巖石結(jié)構(gòu)疏松，砂體厚度為20～40 m。含礦層中含有較多的碳屑和植物殘骸等有機(jī)質(zhì)[19-20]。含砂礦體自北向南依次發(fā)育了氧化帶—氧化還原帶—還原帶的巖石地球化學(xué)分帶。氧化帶在地表為褐黃色,鉆孔中為淺灰綠色、淺灰藍(lán)色,氧化還原前鋒線平面上總體呈東西向展布,形態(tài)為復(fù)雜的蛇曲狀；氧化還原過渡帶呈灰色、淺灰色,富含有機(jī)質(zhì)和結(jié)核狀黃鐵礦；還原帶呈灰色,富含有機(jī)質(zhì),可見結(jié)晶狀黃鐵礦。鈾礦化產(chǎn)于層間氧化還原帶前鋒線附近,鈾礦體呈卷狀、板狀和透鏡狀[21]（圖1）。

圖1 鄂爾多斯盆地東勝地區(qū)地質(zhì)略圖[21]Fig.1 Brief geological map of the Dongsheng area[21]

2 材料與方法

2.1 樣品來源與處理

研究樣品采自東勝鈾礦床直羅組下段含礦砂巖層及頂板圍巖，他們分別分布于氧化帶、氧化—還原帶和還原帶，采集后置于無菌包裝袋中帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行成分分析和菌類分離鑒定和成礦模擬實(shí)驗(yàn)。樣品特征及其中的鈾和有機(jī)碳含量如表1所示。

表1 巖石樣品參數(shù)Table 1 Parameters of the samples

2.2 SRB的富集培養(yǎng)

依據(jù)參考文獻(xiàn)配制硫酸鹽還原菌培養(yǎng)基：Starkey培養(yǎng)基（STK）[22-23]，富集得到菌體后利用微生物方法進(jìn)行分離鑒定工作。

2.3 SRB的計(jì)數(shù)

最大可能數(shù)量法（MPN法）[24]。

2.4 生長曲線的制作

依據(jù)測定硫離子濃度制作SRB生長曲線[25]。

2.5 SRB的分離、鑒定

細(xì)菌分離方法參照文獻(xiàn)［22?23］進(jìn)行、并依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》（第八版）進(jìn)行鑒定。

2.6 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中各成分的分析測定方法

（1）巖石中鈾的測定方法

依據(jù)EJ 349.2—1988巖石中微量鈾的分析方法進(jìn)行檢測。

（2）水中鈾的測定方法

依據(jù)GB/T6768—1986水中微量鈾分析方法進(jìn)行檢測。

（3）巖石中有機(jī)碳測定方法

依據(jù)DZ48—1987巖石中有機(jī)碳分析方法進(jìn)行檢測。

（4）pH值測定方法

依據(jù)DZ/T0064.5—1993地下水質(zhì)檢測方法進(jìn)行檢測。

（5）Eh值測定方法

依據(jù)DZ/T0064.7—1993地下水質(zhì)檢測方法進(jìn)行檢測。

（6）H2S測定方法

用醋酸鋅溶液吸收H2S，再用碘量法滴定。

2.7 SRB對鈾礦地下水質(zhì)影響

為驗(yàn)證SRB對鈾礦地下水中的鈾具有還原作用，從研究區(qū)三個(gè)點(diǎn)取地下水樣（成分分析見表2），立即放入高壓滅菌過的BOD（生物需氧量）瓶中，以防止與空氣接觸。帶回實(shí)驗(yàn)室等比混合后，再按體積比例加入20%STK培養(yǎng)基，為SRB提供其生長代謝所需營養(yǎng)成分，同時(shí)可提高實(shí)驗(yàn)速度，置滅菌鍋121℃滅菌30 min，消除水中其他微生物的因素干擾，冷卻后在超凈工作臺(tái)分別接種分離得到的各種SRB，以比較它們對鈾的還原能力。同時(shí)做無菌實(shí)驗(yàn)液空白對照，以排除STK培養(yǎng)基的非生物因素干擾。用無菌液體石蠟隔氧情況下28℃恒溫靜置培養(yǎng)，45天后進(jìn)行檢測。

表2 鈾礦地下水成分分析Table 2 Analysis of groundwater composition in uranium deposit

2.8 SRB對鈾的固定機(jī)制實(shí)驗(yàn)

2.7實(shí)驗(yàn)完成后，取部分菌液，用離心機(jī)4000rpm離心20 min，獲取細(xì)胞后檢測菌體細(xì)胞攜帶的鈾含量。

2.9 SRB—水—巖成礦模擬實(shí)驗(yàn)

為模擬礦床天然狀態(tài)下菌—水—巖的生物地球化學(xué)反應(yīng)在成礦中的作用，分別在表1不同巖石樣中按照固液比1:1加入地下水混合液，121℃滅菌30 min后，定量接入SRB混合菌液；同時(shí)做無菌的水—巖空白對照，以排除實(shí)驗(yàn)體系中非生物因素的干擾。用無菌液體石蠟液封后置28℃恒溫靜置培養(yǎng)，60天后對各成分進(jìn)行檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 各亞帶巖石樣品中SRB的分布

對各亞帶巖石樣品中的SRB種類分布和菌株數(shù)量進(jìn)行研究。結(jié)果見表3。

表3 鈾礦巖石樣品中SRB分布Table 3 Distribution of SRB in the uranium deposit

從鈾礦巖石樣品中共分離得到了68株SRB，對它們分純后鑒定至種，可知它們分別屬于脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）的脫硫脫硫弧菌（D.densulfuricans）和普通脫硫弧菌（D.vulgaris），以及脫硫腸狀菌屬的（Desulfotomaculum）的東方脫硫腸狀菌（D.orientis）（圖2）。其中D.densulfuricans和D.vulgaris尺寸為（0.5～1）×3μm，彎桿狀或弧形，單端叢生鞭毛，不形成芽孢，革蘭氏染色陰性，有機(jī)化能異養(yǎng)菌，以厭氧呼吸還原硫或其它可還原的硫化合物為H2S獲取能量，能使含鐵鹽的培養(yǎng)基變黑，常和沉淀的FeS有關(guān)，在含有過量亞鐵鹽的硫酸鹽洋菜中，可產(chǎn)生全黑的圓形菌落，最適生長溫度25℃～30℃，但與菌體所生環(huán)境有關(guān)。D.orientis呈直桿狀，約3μm×6μm，周生鞭毛，為嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陰性菌，同樣可在含硫酸鹽培養(yǎng)基中可產(chǎn)生H2S，最適生長溫度35℃～55℃，最高可達(dá)70℃，可在30℃以下生長。

圖2 SRB顯微攝像圖（×1000）Fig.2 Microphotographs of SRB（×1000）

從表3中數(shù)據(jù)可以看出，三者分布具備一定的生物地球化學(xué)分帶性，D.densulfuricans主要分布于氧化帶和氧化—還原帶，還原帶未有分布，D.vulgaris僅在氧化帶有分布，而D.orientis在三個(gè)亞帶均有分布，而且數(shù)量相比較前兩者更大。結(jié)合它們各自的理化特點(diǎn)可以發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)屬的菌差別主要在最適生長溫度和是否可產(chǎn)生芽孢兩方面，每種微生物都有自己的最適生長溫度，D.orientis具有更寬的最適溫度范圍，同時(shí)對于高溫的耐受能力明顯強(qiáng)于D.densulfuricans和D.vulgaris，而對于高溫的耐受能力和其自身可產(chǎn)生芽孢有關(guān)，芽孢的獨(dú)特結(jié)構(gòu)有助于菌體抵抗高溫、電離輻射和有毒成分等不良環(huán)境，為菌體能在礦床的廣泛存在提供了保障，不具備芽孢結(jié)構(gòu)的菌體，在遇到不適合自身生長的環(huán)境時(shí)，其適應(yīng)力明顯不足，尤其是在還原帶含鈾量高的環(huán)境，鈾的毒性和電離輻射導(dǎo)致其在還原帶不易存活。另外菌體的分布也和礦石的含碳量有關(guān)，氧化帶有機(jī)碳含量豐富，為各種SRB的生長繁殖提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，所以菌體種類較多。

3.2 SRB對地下水中鈾的還原結(jié)果分析

從表4中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，無菌的STK本身可影響鈾的還原率，扣除此非生物因素后，仍然可以明顯看到SRB對鈾的還原作用，菌體利用STK中的營養(yǎng)成分繁殖，在代謝過程中導(dǎo)致環(huán)境pH上升，Eh下降，產(chǎn)生H2S。三個(gè)有菌實(shí)驗(yàn)體系比較而言，還原能力最強(qiáng)的為D.orientis，這是因?yàn)槠渚w結(jié)構(gòu)決定了其具備更強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，保證其大量增殖后具備群體的數(shù)量優(yōu)勢，是東勝鈾礦床中的優(yōu)勢種群。

此實(shí)驗(yàn)證明微生物的活動(dòng)可以通過改變自然水環(huán)境的化學(xué)性質(zhì)（pH、氧化還原電位，H2S），通過產(chǎn)生還原作用或通過直接在細(xì)胞上或細(xì)胞內(nèi)積累來影響鈾的狀態(tài)[26]。

為研究分離到的三個(gè)種的菌株的生長規(guī)律，在實(shí)驗(yàn)過程中，每隔5天檢測試驗(yàn)系統(tǒng)中菌體數(shù)量，求對數(shù)后對時(shí)間做菌體對數(shù)生長曲線，如圖3所示，從圖中可知分離純化后的SRB可能因失去了共生微生物的協(xié)同作用，它們在地下水中生長繁殖速度相對常見微生物要慢，延滯期為10～20天，D.orientis因具有芽孢結(jié)構(gòu)，適應(yīng)力較強(qiáng)，延滯期相對較短，大約10天后菌體適應(yīng)了含鈾環(huán)境，進(jìn)入增速很快的對數(shù)期，并且將數(shù)量優(yōu)勢一直保持到試驗(yàn)結(jié)束，這和它導(dǎo)致的鈾的高還原率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符；對數(shù)期是菌體最為活躍的時(shí)期，代謝活躍，新生成的數(shù)量遠(yuǎn)大于死亡的數(shù)量，它們充分利用環(huán)境中的營養(yǎng)成分合成自身所需成分；隨著菌體數(shù)量的增加和環(huán)境中營養(yǎng)成分的降低，新生成的菌體數(shù)量和死亡的菌體逐漸呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)平衡，活菌數(shù)達(dá)到最高峰，此時(shí)期是菌群對環(huán)境改造能力最強(qiáng)的時(shí)期；隨著時(shí)間推移，環(huán)境中營養(yǎng)成分已經(jīng)不足以滿足菌體的大量需求，同時(shí)菌體代謝后形成的副產(chǎn)物越來越多，菌體進(jìn)入衰亡期，并最終完成完整的生命周期。需要說明的是，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的系統(tǒng)為靜止和封閉的環(huán)境，不存在和外界的物質(zhì)和能量傳遞，和天然狀態(tài)下的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定的環(huán)境存在較大差別，這種差別類似于微生物的分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。自然狀態(tài)的環(huán)境處于相對動(dòng)態(tài)的平衡，可為SRB持續(xù)的提供營養(yǎng)成分，同時(shí)把有害物質(zhì)稀釋，其穩(wěn)定期會(huì)持續(xù)更久，所以它們對成礦的貢獻(xiàn)應(yīng)大于模擬實(shí)驗(yàn)檢測的數(shù)據(jù)。

圖3 SRB生長曲線（SRB含量隨時(shí)間的變化情況）Fig.3 SRB growth curve(SRB content changes vs.time)

3.3 SRB對鈾的固定機(jī)制結(jié)果分析

研究表明，微生物群體有固定金屬的能力。不同微生物固定金屬的機(jī)制主要包括：1）沉淀代謝物于細(xì)胞內(nèi)或者細(xì)胞表面及胞外聚合物內(nèi)；2）與表面吸收或離子吸附有關(guān)的被動(dòng)積累；3）與磷酸鹽等無機(jī)配體反應(yīng)沉淀；4）促進(jìn)不溶化合物沉淀于細(xì)胞外部；5）還原可溶性金屬形成無機(jī)礦物[27-29]。

為驗(yàn)證SRB在成礦中的機(jī)制，將還原鈾實(shí)驗(yàn)液經(jīng)離心后收集細(xì)胞，檢測鈾在菌體細(xì)胞內(nèi)外的攜帶量，數(shù)據(jù)表明菌體細(xì)胞中鈾的攜帶量僅為液體中鈾減少量的10%左右，再排除純化學(xué)作用在成礦中的影響因素，基本可以確定SRB通過產(chǎn)生的H2S的還原作用，促使鈾從地下水向巖石中沉淀富集，是微生物成礦中的主要影響因素。

SRB適合在pH中性或偏堿性的環(huán)境中存在。它們以環(huán)境中賦存的有機(jī)質(zhì)作為氧化介質(zhì)，氧化放出的電子將周圍的SO2-4還原為H2S，從中獲取其生長繁殖和代謝所需要的能量[30]。產(chǎn)生的H2S能將U(VI)還原為U（IV）。

這種菌—鈾相互作用機(jī)制的存在，不僅通過氧化還原或改變流動(dòng)性、溶解度來改善鈾的環(huán)境分布，而且保證了微生物在不斷變化的環(huán)境中的適應(yīng)性。所有這些相互作用機(jī)制最終改變了鈾的流動(dòng)性[31]。

3.4 SRB—水—巖成礦模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

從表5中數(shù)據(jù)可以看出，6個(gè)礦石樣分別做了有菌/無菌對照試驗(yàn)，有菌組對照無菌組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，鈾的還原率明顯更高，對有菌實(shí)驗(yàn)組菌數(shù)量級進(jìn)行定量計(jì)算，發(fā)現(xiàn)6組中的菌數(shù)均呈現(xiàn)數(shù)倍增長，說明SRB可以利用巖石中賦存的營養(yǎng)成分進(jìn)行生長繁殖，在其生命過程中改變環(huán)境諸多因素，如pH上升、氧化還原電位下降、產(chǎn)生H2S氣體等有規(guī)律可循的現(xiàn)象，而無菌對照組各數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)前后未發(fā)現(xiàn)明顯改變。

表5 SRB對U(VI)的還原作用Table 5 Reduction of U(VI)by SRB

對6組有菌模擬實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)橫向?qū)Ρ瓤梢园l(fā)現(xiàn)，前三組模擬系統(tǒng)中菌數(shù)增長相對較多，后三組有增長但相對較少，結(jié)合巖石樣成分及SRB生理特點(diǎn)進(jìn)行分析，這些細(xì)菌在還原反應(yīng)中多利用有機(jī)物作為電子供體，也有一些利用氫作為電子供體，因此巖樣中有機(jī)物含量在一定程度上影響著SRB的生長和繁殖；同時(shí)菌體數(shù)目和鈾含量呈反比，可見鈾的濃度對SRB有一定影響。盡管鈾對大部分生物有明顯的毒性和放射性，但是在研究中發(fā)現(xiàn)許多微生物仍能存活，尤其是具芽孢的D.orientis，可在富含鈾的環(huán)境中大量繁殖，應(yīng)為長期共存對環(huán)境的適應(yīng)后不斷進(jìn)化的結(jié)果。除具備被動(dòng)適應(yīng)能力外，SRB還通過自身生化反應(yīng)來主動(dòng)改變鈾的可溶狀態(tài)，促使菌體周圍微環(huán)境中鈾濃度減小，達(dá)到自我保護(hù)的目的，此過程導(dǎo)致鈾的流動(dòng)性減少并最終沉積于巖石中。這種金屬元素在可溶相和不可溶相之間的轉(zhuǎn)變也是金屬生物地球化學(xué)的核心，為微生物反應(yīng)和元素循環(huán)之間提供了直接的聯(lián)系。由此可見，微生物與鈾的相互作用是極其重要的，并且在成礦作用方面，成為除物理和化學(xué)外的第三大重要因素[32]。

4 結(jié)論

礦物和巖石是微生物在各種維度上相互作用的最基本的地球物質(zhì)，礦物質(zhì)和巖石為微生物提供了營養(yǎng)和棲息地，微生物在與離子或者礦物元素及有機(jī)物的得失電子的作用（氧化還原作用）中完成它自己的新陳代謝活動(dòng)進(jìn)而得以生存，是地質(zhì)化學(xué)過程中活躍物質(zhì)的生產(chǎn)者和消費(fèi)者，它們通過對礦物溶解度和物質(zhì)遷移來影響巖石和礦物的風(fēng)化和成巖作用。

（1）通過對東勝砂巖型鈾礦床中最主要的微生物類型——SRB的賦存種類以及它們在成礦過程中的模擬實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)SRB的分布與礦床分帶性和圍巖環(huán)境中各因素有密切關(guān)系，環(huán)境中營養(yǎng)物為菌體生長繁殖的限制因子，SRB通過與礦床長期共存提高了自身對不良環(huán)境的適應(yīng)能力，還能從環(huán)境中汲取所需營養(yǎng)時(shí)通過自身生化反應(yīng)主動(dòng)改變鈾的價(jià)態(tài)和溶解度，改善菌體所處環(huán)境的微生態(tài)，最終促使了鈾元素從地下水向巖石的沉淀、析出和礦化。

（2）成礦作用包括了物理成礦、化學(xué)成礦和生物成礦以及它們的協(xié)同作用，微生物在成礦過程中發(fā)揮了多大的作用，還有待于通過多因素模擬實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。微生物和物理、化學(xué)因素的協(xié)同成礦作用豐富了國內(nèi)砂巖型鈾礦成礦的理論，對于通過微生物分布規(guī)律找礦、鈾礦地浸開采和退役鈾礦地下水污染治理同樣具有參考價(jià)值。