貢 嘎 ， 羅潤(rùn)波 ， 唐 堯 ， 崔子航 ， 周賽賽 ， 索朗斯珠

(西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 ， 西藏 林芝 860000)

牛傳染性角膜結(jié)膜炎是由牛摩拉氏菌(Moraxellabovis)引起的一種眼病，全世界均有流行。我國(guó)甘肅、四川、青海等地也有相關(guān)報(bào)道[1]。2018年9月份，西藏林芝某縣牦牛養(yǎng)殖戶(hù)部分牦牛眼睛先后出現(xiàn)紅腫、流淚，嚴(yán)重者出現(xiàn)失明情況。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病自然發(fā)病病程達(dá)8個(gè)月，發(fā)病率95%以上，病牛體溫高達(dá)38.1 ℃。筆者于2018年9月采集發(fā)病牦牛眼拭子，采用細(xì)菌學(xué)分離法進(jìn)行細(xì)菌分離，通過(guò)生化及PCR方法鑒定分離菌株，確定該地區(qū)牦牛眼病發(fā)病病因，介紹如下。

1 材料與方法

1.1 病料 從西藏林芝市某縣牦牛養(yǎng)殖戶(hù)采集發(fā)病牦牛眼拭子10份，保存于-20 ℃，待檢。

1.2 主要試劑 PCR試劑、DL2 000 DNA marker、克隆載體pMD18-T、細(xì)菌基因組提取試劑盒，均購(gòu)自TaKaRa公司；感受態(tài)細(xì)胞Trans5α由本實(shí)驗(yàn)室制備保存；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；血平板，購(gòu)自齊一生物科技有限公司；青霉素、頭孢氨芐、頭孢曲松、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢他啶、氨芐西林、新霉素、多西環(huán)素、慶大霉素、卡那霉素、紅霉素共12種抗菌藥物，均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及純化 無(wú)菌棉簽采集患病牦牛眼拭子，接種于血平板，37 ℃ 需氧培養(yǎng) 18 h。將分離的單個(gè)菌落劃線接種于血平板上，37 ℃培養(yǎng) 18 h 進(jìn)行純化。

1.4 染色鏡檢 將單個(gè)菌落涂片革蘭染色后鏡檢。

1.5 生化試驗(yàn) 取血瓊脂平板上典型的單菌落接種于靛基質(zhì)、氧化酶、還原硝酸鹽、石蕊牛奶等進(jìn)行細(xì)菌生化試驗(yàn)。

1.6 分離菌株的16S rDNA基因序列測(cè)定 引物序列參照參考文獻(xiàn)[2]，上游引物：5′-ATGGCTCATTGAACGC-3′；下游引物：5′-CAGGTTCCCCTACGGTTA-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，退火溫度：50 ℃。PCR反應(yīng)在25 μL體系中進(jìn)行：GreenTaqMix 5.2 μL，上游及下游引物各1 μL， 模板DNA 0.5 μL，ddH2O 17.3 μL。

1.7 藥敏試驗(yàn) 取普通肉湯培養(yǎng)物涂布于血平板，將藥敏紙片貼壓于平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(NCCLS)2013年公布的標(biāo)準(zhǔn)，以敏感 (Sensitive)、中介(Intermediate)、耐藥 (Resistant)形式對(duì)抑菌圈大小作出判定。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 牦牛眼拭子接種于血平板，37 ℃ 培養(yǎng)18 h 后進(jìn)行純化培養(yǎng)，純化后菌落生長(zhǎng)大小不一，呈乳白色，略微凸起，不透明，光澤濕潤(rùn)，邊緣整齊且無(wú)黏性(中插彩版圖1)。

圖1 血瓊脂平板上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology on blood agar plate

2.2 染色鏡檢 對(duì)純化后的菌落進(jìn)行革蘭染色后鏡檢，分離菌株為革蘭陰性球桿菌，單個(gè)或成雙排列，菌體兩端鈍圓(中插彩版圖2)。

圖2 分離菌革蘭染色結(jié)果 (1 000×)Fig.2 Gram staining results of isolates (1 000×)

2.3 生化試驗(yàn) 分離菌的生化特性與牛摩拉氏菌的生化特性基本一致。葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖和尿素酶呈陰性，靛基質(zhì)氧化酶和還原硝酸鹽呈陽(yáng)性。初步確定分離菌為牛摩拉氏菌。

2.4 PCR鑒定 分離菌PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在含1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可以見(jiàn)到1條清晰的目的條帶，大小與預(yù)期結(jié)果相符，見(jiàn)圖3。

圖3 分離菌株16S rDNA 的 PCR 擴(kuò)增Fig.3 16S rDNA of isolated strain amplified by PCRM： DNA分子量標(biāo)記(DL 2 000 DNA marker)； 1： 樣品M： DNA molecular weight marker(DL 2 000 DNA marker)； 1: Sample

2.5 藥敏試驗(yàn) 選用12種獸醫(yī)臨床中常用的抗菌藥物對(duì)分離菌株進(jìn)行耐藥性測(cè)定。結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)所選用的抗菌藥物有不同程度的耐藥現(xiàn)象，對(duì)頭孢唑啉、頭孢呋辛、氨芐西林、新霉素、多西環(huán)素、慶大霉素敏感，對(duì)紅霉素、卡那霉素、頭孢曲松、頭孢氨芐呈中介，對(duì)青霉素、頭孢他啶產(chǎn)生耐藥。見(jiàn)表1。

表1 藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criterion of antibiotics sensitivity tests

3 討論

牛傳染性角膜結(jié)膜炎是摩拉氏菌引起的牛常見(jiàn)的眼部疾病，也稱(chēng)“紅眼病”，可導(dǎo)致牛眼流淚、角膜潰瘍、眼部疼痛，甚至造成牛的永久性失明，給養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外不斷有從患傳染性角膜結(jié)膜炎的牛眼部分離到犢牛摩拉氏菌的報(bào)道[6]。而西藏牦牛傳染性角膜結(jié)膜炎的研究鮮有報(bào)道。

西藏是我國(guó)五大牧區(qū)之一，牦牛是西藏地區(qū)主要的支柱產(chǎn)業(yè)，其提供的產(chǎn)品對(duì)當(dāng)?shù)啬撩竦囊率匙⌒衅鹬鵁o(wú)可替代的作用[7]。有文獻(xiàn)報(bào)道，紫外線是牛摩拉氏菌致病的重要誘因。西藏林芝地處西藏自治區(qū)東南部，地處北緯26°52′～30°40′，東經(jīng)92°09′～98°47′，藏語(yǔ)意為“太陽(yáng)的寶座”，平均海拔3 500 m左右，夏秋季節(jié)光照時(shí)間長(zhǎng)，日光中紫外線特別強(qiáng)烈，這與牦牛傳染性角膜結(jié)膜炎發(fā)生有關(guān)。

本試驗(yàn)從西藏林芝市某縣發(fā)病牦牛眼拭子中分離到1株革蘭陰性球桿菌，單個(gè)或成雙排列，菌體兩端鈍圓，經(jīng)生化及PCR鑒定為牦牛摩拉氏菌(傳染性角膜結(jié)膜炎病原體)。此外，本次分離的菌株對(duì)青霉素、頭孢他啶產(chǎn)生耐藥，對(duì)頭孢氨芐、頭孢曲松、卡那霉素和紅霉素呈中介，對(duì)頭孢唑啉、頭孢呋辛、氨芐西林、新霉素、多西環(huán)素和慶大霉素較敏感，其中對(duì)多西環(huán)素最為敏感。

牛傳染性角膜結(jié)膜炎的發(fā)生除了病原菌的存在外，與強(qiáng)烈的太陽(yáng)紫外光照射有著密切的聯(lián)系[8]，這與西藏環(huán)境特點(diǎn)完全符合，因此大大增加了牦?！凹t眼病”的發(fā)生，且西藏牦牛養(yǎng)殖戶(hù)的文化水平相對(duì)較低，也未受過(guò)系統(tǒng)的抗菌藥物使用的相關(guān)培訓(xùn)，容易產(chǎn)生抗菌藥物耐藥現(xiàn)象。因此，建議獸醫(yī)臨床用藥應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，有針對(duì)性地使用抗菌藥，而且必須經(jīng)常更換抗菌藥種類(lèi)，以免產(chǎn)生耐藥菌株，此外，需要大力宣傳細(xì)菌耐藥性等相關(guān)專(zhuān)業(yè)知識(shí)，提高老百姓對(duì)細(xì)菌耐藥性的意識(shí)，做到家喻戶(hù)曉，人人皆知。