胡曉鳳，王家福，尹忠良，康 斌，李建林，李少麗

(杭州佑本動(dòng)物疫苗有限公司，浙江 杭州 310018)

支原體是一類(lèi)沒(méi)有細(xì)胞壁、高度多形性、能通過(guò)濾菌器且可用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖的原核生物，大小為0.1 μm～0.3 μm。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中污染支原體是常見(jiàn)問(wèn)題，常見(jiàn)的支原體有口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體和萊氏無(wú)膽甾原體(Acholeplasma Laidlawii)，有的細(xì)胞株可同時(shí)污染兩種以上支原體。當(dāng)特別重要的細(xì)胞株或病毒污染支原體時(shí)，要對(duì)其清除，最常用且最簡(jiǎn)便的方法是用抗生素處理。

本研究擬清除豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)中污染的支原體，旨在保證病毒的純凈性。研究在Mar145細(xì)胞培養(yǎng)液中加入支原體清除劑，優(yōu)化細(xì)胞耐受該試劑的工作濃度，在加入清除劑的細(xì)胞培養(yǎng)液中接種PRRSV，盲傳6代后進(jìn)行支原體PCR檢測(cè)，電泳顯示支原體陰性，表明PRRSV中污染的支原體得到了徹底清除。

1 試驗(yàn)材料

PRRSV及Marc145細(xì)胞(杭州佑本動(dòng)物疫苗有限公司CNAS檢測(cè)中心提供)；支原體清除劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；支原體PCR檢測(cè)試劑盒(哈爾濱世紀(jì)元亨生物科技公司)；0.1 μm濾菌器(美國(guó)Millipore公司)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)；胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 Marc145細(xì)胞耐受支原體清除劑工作濃度的優(yōu)化

用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在6孔板中培養(yǎng)Marc145細(xì)胞，分別加入終濃度為10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL的支原體清除劑，同時(shí)設(shè)Marc145細(xì)胞空白對(duì)照孔，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照此方法盲傳3代，根據(jù)Marc145細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)確定支原體清除劑的最適工作濃度。

2.2 PRRSV中支原體的清除

在Marc145單層細(xì)胞培養(yǎng)液中按照培養(yǎng)液體積3%～5%的比例接種PRRSV，吸附1 h，然后加入25 μg/mL的支原體清除劑，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。盲傳3代，不加支原體清除劑繼續(xù)盲傳3代，按照支原體PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行支原體PCR檢測(cè)。

2.3 PRRSV的病毒效價(jià)測(cè)定

將最后一代盲傳的PRRSV以及清除前的PRRSV分別接種96孔板，按照Reed和Muench法進(jìn)行病毒效價(jià)測(cè)定。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 Marc145細(xì)胞耐受支原體清除劑工作濃度的優(yōu)化結(jié)果

在Marc145細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為12.5 μg/mL、25 μg/mL、37.5 μg/mL的支原體清除劑，培養(yǎng)3代后顯微鏡觀察，可見(jiàn)所有孔中Marc145細(xì)胞狀態(tài)正常，且各孔之間無(wú)明顯差異，確定Marc145細(xì)胞耐受支原體清除劑的工作濃度范圍為12.5 μg/mL～37.5 μg/mL，考慮支原體清除劑濃度太大對(duì)細(xì)胞可能造成不易觀察的細(xì)微病變，最終，將其最適濃度確定為25 μg/mL(圖1)。

3.2 PRRSV中支原體的清除試驗(yàn)結(jié)果

將支原體清除劑按照終濃度25 μg/mL加入PRRSV培養(yǎng)液，盲傳3代，48 h～52 h后細(xì)胞出現(xiàn)明顯的聚堆、脫落等病變。然后不加支原體清除劑再盲傳3代，最后對(duì)用支原體清除劑清除的F3代PRRSV及之后盲傳的3代(F4～F6)PRRSV進(jìn)行支原體PCR檢測(cè)，電泳結(jié)果顯示，所有檢測(cè)PRRSV樣品未在602 bp處出現(xiàn)特異性條帶，表明PRRSV中支原體徹底清除(圖2)。

3.3 PRRSV的病毒效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

按照Reed和Muench法檢測(cè)PRRSV清除前、后的病毒效價(jià)分別為107.3TCID50/mL和107.5TCID50/mL。將支原體完全清除的PRRSV做好標(biāo)記，-80 ℃凍存。

4 討論

支原體廣泛存在于我們生活的環(huán)境中，一般不致病，但若在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)或者病毒分離過(guò)程中污染了支原體，則會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)或病毒效價(jià)，此時(shí)需要對(duì)支原體進(jìn)行清除。不同細(xì)胞對(duì)支原體清除劑的耐受濃度不同，支原體清除劑濃度太大會(huì)阻礙細(xì)胞生長(zhǎng)，甚至影響細(xì)胞狀態(tài)，而濃度太小又起不到抑制或清除效果。本試驗(yàn)首先優(yōu)化了Marc145細(xì)胞耐受支原體清除劑的最佳工作濃度，確定細(xì)胞可以在終濃度為12.5 μg/mL～37.5 μg/mL的細(xì)胞培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，考慮支原體清除劑濃度太大對(duì)細(xì)胞可能造成不易觀察到的細(xì)微病變，最終，將其最適濃度確定為25 μg/mL。另外，加入支原體清除劑或其他清除試劑后病毒至少要正常培養(yǎng)3代才可以檢測(cè)，以便更客觀評(píng)價(jià)支原體的清除效果。

采用商品化的抗生素清除支原體時(shí)，當(dāng)支原體含量較高時(shí)需要加大抗生素用量或多清除幾代，有時(shí)還需要使用0.1 μm濾菌器過(guò)濾以降低支原體含量。此外，支原體清除劑屬于抗生素，若長(zhǎng)期使用一種抗生素可能會(huì)使支原體產(chǎn)生耐藥性，建議不同類(lèi)清除劑交替使用。