劉亞楠，李 歡，陳 劍，蘇來金，傅玲琳，王彥波,*

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，溫州市特色食品資源工程技術(shù)研究中心，浙江 溫州 325000）

水產(chǎn)品富含優(yōu)質(zhì)蛋白和其他重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是人類食物的重要來源之一。研究表明，截至2050年，來自海洋的食品年總產(chǎn)量將比當(dāng)前增加36%～74%，可提供 相當(dāng)于98億 人口所需肉類總增量的12%～25%[1]。水產(chǎn)品含有豐富的蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但極易滋生大量微生物而發(fā)生腐敗變質(zhì)，產(chǎn)生生物胺。生物胺是一類具有生物活性、低分子質(zhì)量堿性含氮化合物的總稱，生物胺的產(chǎn)生途徑有兩種：由含氨基酸脫羧酶的微生物作用于游離氨基酸脫羧產(chǎn)生；由醛酮類化合物的氨基化和轉(zhuǎn)氨基作用生成[2-3]。水產(chǎn)品中常見的生物胺有8 種，根據(jù)分子結(jié)構(gòu)特征可分為3大類：脂肪族胺（腐胺、尸胺、精胺和亞精胺）、芳香族胺（酪胺和苯乙胺）和雜環(huán)胺（組胺和色胺）[3-4]；根據(jù)氨基數(shù)目分為單胺（組胺、酪胺、色胺和苯乙胺）和多胺（尸胺、腐胺、精胺和亞精胺）[4]。

適量的生物胺是人體中必不可少的組成部分，具有調(diào)節(jié)核酸與蛋白質(zhì)合成及生物膜穩(wěn)定性的作用[4]。但是過量生物胺則會(huì)對(duì)人體造成一定的傷害，如攝入3 mg的苯乙胺會(huì)引起偏頭痛、8～40 mg的組胺即可引起輕微中毒[4]。 水產(chǎn)品等蛋白質(zhì)含量豐富的食品在加工和保藏過程中極易產(chǎn)生生物胺。生物胺無法通過低溫冷凍或者高溫加熱等方式消除[5]，且一旦誤食含有大量生物胺的食品，可能會(huì)引起嘔吐、腹瀉等食物中毒現(xiàn)象。鑒于此，水產(chǎn)品中生物胺超標(biāo)問題引起了政府和公眾的廣泛關(guān)注，及時(shí)發(fā)現(xiàn)水產(chǎn)品中過量的生物胺，保障水產(chǎn)品品質(zhì)和食用安全，就顯得尤為重要。建立準(zhǔn)確、快速的生物胺檢測(cè)方法，高效精準(zhǔn)地檢測(cè)水產(chǎn)品中生物胺的種類和含量，是保障水產(chǎn)品食用品質(zhì)和安全的重要基礎(chǔ)，也逐漸成為保障水產(chǎn)品食用品質(zhì)和安全的研究熱點(diǎn)。

1 水產(chǎn)品中的生物胺

1.1 生物胺形成機(jī)制

生物胺廣泛存在于食品尤其是富含蛋白質(zhì)的水產(chǎn)品中。水產(chǎn)品中生物胺的產(chǎn)生主要是水產(chǎn)品中蛋白質(zhì)在蛋白酶和肽酶的作用下分解為氨基酸，繼而在微生物氨基酸脫羧酶的作用下進(jìn)行脫羧反應(yīng)產(chǎn)生生物胺。水產(chǎn)品中的微生物并非都含氨基酸脫羧酶，且所攜帶的氨基酸脫羧酶不同，生成的生物胺種類也不同。研究表明[6-8]，葡萄球菌（Staphylococcus），弧菌（Vibrio），肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和假單胞菌（Pseudomonas）是水產(chǎn)品中主要的組胺產(chǎn)生菌；芽孢桿菌（Paenibacillus）和肉食桿菌（Carnobacterium divergens）是主要的酪胺產(chǎn)生菌株；大腸桿菌（Escherichia coli）和阿氏腸桿菌（Enterobacter asburiae）是主要的腐胺產(chǎn)生菌株；產(chǎn)酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）、植生拉烏爾菌（Raoultella planticola）和抗壞血酸克呂沃爾菌（Kluyvera ascorbata）是主要的尸胺產(chǎn)生菌種。除需要有前體物質(zhì)氨基酸和含氨基酸脫羧酶的微生物外，生物胺的合成還需要具有滿足適宜含氨基酸脫羧酶的微生物生長(zhǎng)以及氨基酸脫羧酶合成與作用的環(huán)境條件[9]，其生物合成途徑如圖1所示。

圖1 生物胺的生物合成途徑[4,10]Fig.1 Biosynthesis pathways of biogenic amines[4,10]

1.2 生物胺對(duì)人體的危害

生物胺是人體內(nèi)必不可少的組成成分，適量的生物胺具有清除自由基，抗氧化[11]，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、基因表達(dá)[12]、心率和細(xì)胞免疫[13]等生理功能。在正常生理?xiàng)l件下，生物胺可以被機(jī)體內(nèi)的胺氧化酶分解代謝。但攝入過量生物胺，超過人體胺氧化酶的代謝能力時(shí)，未被代謝的生物胺則會(huì)在體內(nèi)堆積對(duì)人體健康產(chǎn)生危害[14-15]。如表1所示，不同生物胺作用于不同器官，產(chǎn)生的毒性有所不同。

表1 不同生物胺的毒性作用Table 1 Toxicity of different biogenic amines

1.3 生物胺在水產(chǎn)品中的限量標(biāo)準(zhǔn)

相關(guān)研究表明，生物胺在水產(chǎn)品中廣泛存在（表2）[18-25]且部分水產(chǎn)品生物胺含量超標(biāo)。過量的生物胺會(huì)引起腹瀉、頭痛等不良反應(yīng)，同時(shí)還可與水產(chǎn)品中的防腐劑亞硝酸鹽反應(yīng)生成亞硝胺等致癌物質(zhì)[7]，危害人體健康。鑒于此，不同國(guó)家對(duì)水產(chǎn)品中的生物胺進(jìn)行限量以保障其食用安全（表3）。

表2 不同水產(chǎn)品生物胺種類和含量Table 2 Types and contents of biogenic amines in different aquatic products

表3 不同國(guó)家對(duì)水產(chǎn)品中生物胺的限量標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Maximum residue limits for biogenic amines in different countries

續(xù)表2

2 生物胺間接檢測(cè)技術(shù)

間接檢測(cè)技術(shù)主要通過測(cè)定水產(chǎn)品中的產(chǎn)胺菌的存在和數(shù)量來實(shí)現(xiàn)，包括微生物學(xué)法和分子生物學(xué)法，產(chǎn)胺菌的存在為證明水產(chǎn)品中生物胺存在提供了一定的參考信息，因此可以作為簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)生物胺存在的方法。但檢測(cè)出產(chǎn)胺菌的存在并不代表產(chǎn)生的生物胺含量一定高，這兩種方法只能作為間接測(cè)定生物胺的方法。因此，將微生物學(xué)法或分子生物學(xué)法與數(shù)學(xué)模型相結(jié)合可作為一種更準(zhǔn)確檢測(cè)是否含有生物胺及生物胺含量的技術(shù)手段。

2.1 微生物學(xué)法

微生物學(xué)法主要是根據(jù)產(chǎn)胺菌的生理特性借助于不同的選擇性培養(yǎng)基來鑒定產(chǎn)胺菌。Niven培養(yǎng)基是最早設(shè)計(jì)也是最常用的選擇性培養(yǎng)基，通過培養(yǎng)基中的酸堿指示劑溴甲酚紫對(duì)產(chǎn)胺菌代謝產(chǎn)物堿性生物胺進(jìn)行顯色從而篩選出產(chǎn)胺菌[29]。但微生物代謝系統(tǒng)復(fù)雜，培養(yǎng)基會(huì)對(duì)其他堿性代謝產(chǎn)物顯色造成假陽性的結(jié)果[30]，Mavromatis等[31]對(duì)Niven培養(yǎng)基進(jìn)行了參數(shù)調(diào)整以降低假陽性率。周衛(wèi)楓等[32]設(shè)計(jì)二步法，采用3 種選擇性培養(yǎng)基分別篩選魚肉中的組胺產(chǎn)生菌后再用比色法進(jìn)行組胺的定性和定量，該方法進(jìn)一步提高了準(zhǔn)確率。Roig-Sagués等[33]同樣根據(jù)二步法用7 種選擇性培養(yǎng)基篩選目標(biāo)產(chǎn)胺菌，已被應(yīng)用于金槍魚和鳳尾魚的產(chǎn)胺菌檢測(cè)中[34-35]。

2.2 分子生物學(xué)法

分子生物學(xué)法檢測(cè)產(chǎn)胺菌主要是基于微生物中 氨基酸脫羧酶基因保守性的原理，其中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是最為廣泛用于檢測(cè)產(chǎn)胺菌的方法。目前，已使用多種脫羧酶基因引物檢測(cè)產(chǎn)胺菌脫羧酶從而實(shí)現(xiàn)產(chǎn)胺菌的檢測(cè)（表4）。 Bj?rnsdóttir-Butler等[36]將4 種高產(chǎn)組胺菌株（Morganella morganii、E.aerogenes、R.planticola和Photobacterium damselae）的組氨酸脫羧酶（histidine decarboxylase，HDC）基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生兩個(gè)片段（709 bp和249 bp）， 將片段用地高辛標(biāo)記后分別檢測(cè)組胺產(chǎn)生菌，發(fā)現(xiàn)709 bp 探針的等比例混合物對(duì)高組胺產(chǎn)生菌株具有高特異性。Wongsariya等[37]根據(jù)11 株組胺產(chǎn)生菌的Hdc基因保守區(qū)構(gòu)建引物（Hdc-2F/2R）用來檢測(cè)M.morganii和E.aerogenes的存在和含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hdc-2F/2R引物能夠在組胺水平低于50 mg/kg時(shí)檢測(cè)出產(chǎn)胺菌M.morganii和E.aerogenes的存在，該方法可以在組胺水平達(dá)到污染控制水平之前檢測(cè)到產(chǎn)胺菌的存在。然而，單一PCR只能檢測(cè)一種產(chǎn)胺菌，當(dāng)需要對(duì)食品中所有重要生物胺的產(chǎn)胺菌檢測(cè)時(shí)則存在耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)，因此多重PCR技術(shù)被應(yīng)用于快速檢測(cè)多種產(chǎn)胺菌。de las Rivas等[38]為了快速檢測(cè)食品中可產(chǎn)生組胺、酪胺、腐胺和尸胺的產(chǎn)胺菌，建立了可同時(shí)檢測(cè)這些產(chǎn)胺菌的多重PCR方法。通過與數(shù)據(jù)庫(kù)中組胺、酪胺、腐胺和尸胺產(chǎn)胺菌蛋白質(zhì)組序列比對(duì)后選擇保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)引物，引物允許相應(yīng)脫羧酶基因的擴(kuò)增但不允許其他基因擴(kuò)增從而篩選出產(chǎn)4 種生物胺的食源性細(xì)菌。多重PCR技術(shù)為快速檢測(cè)水產(chǎn)品中產(chǎn)胺菌提供了一種可靠的診斷工具，也為生物胺風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警提供參考依據(jù)。

表4 檢測(cè)產(chǎn)胺菌的氨基酸脫羧酶PCR引物Table 4 Polymerase chain reaction primers for detecting amino acid decarboxylases

3 直接檢測(cè)技術(shù)

3.1 基于色譜法檢測(cè)生物胺

基于色譜法檢測(cè)生物胺是因?yàn)椴煌锇防砘再|(zhì)不同，可利用與固定相之間的親和力差異實(shí)現(xiàn)生物胺 與其他物質(zhì)的分離，再結(jié)合各類檢測(cè)器進(jìn)行分析。其中常見的檢測(cè)方法有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、氣相色譜（gas chromatographic，GC）法、薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）法等（表5）。其中HPLC是最常用的方法，HPLC利用樣品中生物胺與其他組分在固定相和流動(dòng)相連續(xù)交換的過程中，由于在兩相之間存在洗脫能力、溶解力等性質(zhì)差異彼此分離，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物胺的檢測(cè)。Altieri等[41]采用反相高效液相色譜（reversedphase HPLC，RP-HPLC）法對(duì)魚和魚產(chǎn)品中組胺含量進(jìn)行檢測(cè)，其檢出限和定量限分別為3 mg/kg和10 mg/kg，但該方法存在檢測(cè)分析時(shí)間較長(zhǎng)的不足。Mayer等[42]為解決HPLC分析生物胺耗時(shí)長(zhǎng)的不足，根據(jù)塔板速率理論使用亞2 μm粒徑的色譜柱對(duì)樣品中的生物胺實(shí)現(xiàn)快速、高效的分離，從而快速檢測(cè)生物胺含量。該方法對(duì)樣品中生物胺的檢出限為1～3.3 mg/kg，分析時(shí)間為9 min，該方法在不降低靈敏度的前提下大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。GC原理和HPLC基本相同，但是主要用于分析揮發(fā)性生物胺，非揮發(fā)性生物胺則需衍生為易揮發(fā)的物質(zhì)才能進(jìn)行檢測(cè)。Li Chenghui等[43]將介質(zhì)阻擋放電分子發(fā)射光譜儀串聯(lián)氣相色譜檢測(cè)鯉魚中二甲胺和三甲胺等揮發(fā)性胺，其中將納米SiO2作為催化劑以增強(qiáng)胺的發(fā)射信號(hào)，檢出限為4.4 μg和2.5 μg。Hwang等[44]采用堿性甲醇提取魚和魚制品中的組胺后直接進(jìn)行檢測(cè)，無需衍生化。該方法檢出限為5 mg/kg，可快速簡(jiǎn)便地檢測(cè)出水產(chǎn)品中的非揮發(fā)性生物胺。HPLC和GC法具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，但存在儀器昴貴、操作費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn)，不適合大批量樣品檢測(cè)。

表5 基于色譜法檢測(cè)水產(chǎn)品中的生物胺Table 5 Recent studies on detection of biogenic amines in aquatic products by chromatography methods

TLC法是利用生物胺與其他物質(zhì)對(duì)吸附劑的吸附能力和分配系數(shù)不同使混合物在固定相上得以分離，根據(jù)樣品比移值與對(duì)照物的比移值確定生物胺含量。 Lapa-Guimar?es等[45]建立了一種用丹磺酰氯衍生生物胺后用熒光密度法進(jìn)行含量檢測(cè)的TLC法，該方法對(duì)色胺、酪胺、組胺和β-苯乙胺的檢出限為10 ng/g，對(duì)胍胺、腐胺、尸胺、精胺、亞精胺的檢出限為5 ng/g。Tao Zhihua等[46]采用TLC法檢測(cè)魚和魚制品中的組胺，利用數(shù)字化計(jì)算和圖像處理軟件對(duì)斑點(diǎn)強(qiáng)度進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。該方法可快速分析出組胺含量，其檢出限為20 mg/kg。TLC法無需昴貴的檢測(cè)設(shè)備，操作簡(jiǎn)便，但準(zhǔn)確度不高、重復(fù)性差。

綜上所述，基于色譜法檢測(cè)生物胺是目前應(yīng)用最為廣泛的分析方法，具有檢測(cè)靈敏度高、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，但大部分方法在分析過程中需對(duì)生物胺進(jìn)行衍生化處理且需要大型分析儀器，因此操作方法更簡(jiǎn)便和研發(fā)小型分析儀器仍然是色譜法檢測(cè)的難點(diǎn)和發(fā)展方向。

3.2 基于免疫識(shí)別檢測(cè)水產(chǎn)品中生物胺

免疫識(shí)別原理是將生物胺作為抗原，利用生物識(shí)別元素與抗原結(jié)合后進(jìn)行含量檢測(cè)。常用的免生物識(shí)別元素有抗體、核酸適配體、肽、分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）等（表6）。

表6 基于免疫識(shí)別檢測(cè)水產(chǎn)品中的生物胺Table 6 Recent studies on detection of biogenic amines in aquatic products based on immune recognition

Sheng Wei等[53]利用競(jìng)爭(zhēng)性多克隆抗體ciELISA法測(cè)定了肉類和海產(chǎn)品中的酪胺含量。將酪胺與牛血清白蛋白（bull serum albumin，BSA）偶聯(lián)作為抗原注射到兔子體內(nèi)以刺激體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)酪胺的抗體，用于ciELISA法檢測(cè)酪胺的含量。該方法對(duì)酪胺的檢出限為1.2 mg/kg，回收率為85.6%～102.6%。在上述方法中由于生物胺分子質(zhì)量小，直接與蛋白偶聯(lián)制備的抗原刺激動(dòng)物體內(nèi)所產(chǎn)生的抗體特異性較差，因此袁利鵬等[54]將組胺衍生化，制備出可特異性識(shí)別組胺衍生物的抗體以此提高特異性和靈敏度，采用Sheng Wei等[53]利用ciELISA法測(cè)定魚、蝦和貝類中組胺含量，該方法的檢出限為0.1 ng/mL，回收率為98.9%～130.1%。

除采用抗體作為生物識(shí)別元素檢測(cè)生物胺外，Lerga等[58]設(shè)計(jì)了一種核酸適配體結(jié)合金納米粒子（gold nanoparticles，AuNPs）檢測(cè)魚肉中的組胺。核酸適配體通過非靜電作用被吸附在AuNPs上，使AuNPs免受鹽誘導(dǎo)聚集，從而保持分散、呈現(xiàn)紅色；當(dāng)目標(biāo)物組胺存在時(shí)，適配體與組胺結(jié)合，核酸適配體從AuNPs上脫離，加鹽誘導(dǎo)AuNPs聚集變成藍(lán)色。該方法可通過納米顆粒的顏色變化直觀檢測(cè)出組胺且靈敏度高，檢測(cè)限為8 nmol/L。Shi Rongjia等[59]通過生物篩選方法從噬菌體展示文庫(kù)中選擇對(duì)組胺具有高親和力的肽，將肽與碳量子點(diǎn)結(jié)合檢測(cè)魚肉中的組胺。碳量子點(diǎn)的熒光電子轉(zhuǎn)移可以被肽猝滅，當(dāng)組胺存在時(shí)可與肽結(jié)合使碳量子點(diǎn)熒光恢復(fù)（圖2），通過這個(gè)原理測(cè)定熒光強(qiáng)度進(jìn)行組胺定量，對(duì)組胺的檢出限為13.0 μg/L。

圖2 NAC-碳量子點(diǎn)/Hisp3-2-C檢測(cè)組胺示意圖[59]Fig.2 Schematic diagram of N-acetyl-cysteine-carbon quantum dots/histamine peptide 3-cysteine for the detection of histamine[59]

近年來，MIP已逐漸替代抗體、核酸適配體等作為一種新型生物識(shí)別元素檢測(cè)水產(chǎn)品中的生物胺。Mattsson等[61]開發(fā)了一種基于競(jìng)爭(zhēng)性的熒光MIP假免疫測(cè)定法檢測(cè)金槍魚罐頭中組胺的含量。該方法利用熒光標(biāo)記的組胺衍生物作為配體和組胺在溶液中共同競(jìng)爭(zhēng)MIP結(jié)合位點(diǎn)的原理，通過測(cè)量熒光強(qiáng)度確定組胺含量，檢出限為1 μmol/L。Gao Fang等[62]利用MIP-聚氯乙烯-SERS法測(cè)定金槍魚中組胺的含量（圖3）。通過AuNPs表面的負(fù)電荷與組胺正電荷的靜電吸引作用，使組胺吸附在AuNPs表面，AuNPs作為表面增強(qiáng)光譜的基底增強(qiáng)組胺光譜信號(hào)以此實(shí)現(xiàn)組胺的檢測(cè)，對(duì)組胺的檢出限為3 mg/kg。

圖3 MIP-聚氯乙烯-SERS法檢測(cè)組胺示意圖[62]Fig.3 Schematic diagram of molecularly imprinted polymer-polyvinyl chloride-surface-enhanced Raman spectroscopy for the detection of histamine[62]

綜上，基于免疫識(shí)別原理制備出的生物識(shí)別元素可特異性檢測(cè)水產(chǎn)品中某一種生物胺，但生物胺分子質(zhì)量較小，制備出的生物識(shí)別元素靈敏度并不高且制備過程耗時(shí)耗力，制備具有高靈敏度的可特異性識(shí)別生物胺的生物識(shí)別元素仍是目前的研究趨勢(shì)。因此將生物胺衍生化后制備生物識(shí)別元素或者結(jié)合納米材料等其他物質(zhì)增強(qiáng)信號(hào)可以提高靈敏度，為精準(zhǔn)檢測(cè)生物胺提供一定的技術(shù)支持。

3.3 基于酶促反應(yīng)檢測(cè)水產(chǎn)品中生物胺

相比較于HPLC、GC、TLC等方法，生物傳感器因其設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、低成本和小型化成為檢測(cè)生物胺的熱點(diǎn)方法，其中基于酶促反應(yīng)的生物傳感器在檢測(cè)水產(chǎn)品生物胺中應(yīng)用十分廣泛?；诿复俜磻?yīng)檢測(cè)生物胺主要是因?yàn)樵诜肿友醯拇嬖谙拢房梢员话费趸复呋a(chǎn)生過氧化氫、氨氣和醛類物質(zhì)，通過測(cè)定這些生成物的產(chǎn)生量或者反應(yīng)物的消耗量可以來描述生物胺的水平。

Omanovic-Miklicanin等[64]基于胺與腐胺氧化酶（putrescine oxidase，PUO）或二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）的酶促反應(yīng)產(chǎn)物過氧化氫可以與魯米諾試劑反應(yīng)發(fā)光的原理制成兩種光學(xué)生物傳感器檢測(cè)魚肉等肉品中的腐胺。兩種傳感器對(duì)腐胺的檢出限分別為 0.8 mg/L和1.3 mg/L，該類傳感器可簡(jiǎn)便、快速地通過顏色變化檢測(cè)生物胺，但檢出限較高。Pospiskova等[65]將酶固定在磁性微粒中，與釕化合物一起封裝到聚合物后沉積到透射電子顯微鏡中，將透射電子顯微鏡通過光纖維連接到光電探測(cè)器中，利用酶促反應(yīng)耗氧催化胺的原理測(cè)量釕化合物的熒光壽命變化進(jìn)行生物胺含量檢測(cè)。該方法中的酶具有長(zhǎng)期活性，對(duì)生物胺的檢出限可達(dá)微摩爾級(jí)，對(duì)腐胺和尸胺靈敏度最高，檢出限為25～30 μmol/L。

Pérez等[66]將DAO和HRP通過相反轉(zhuǎn)技術(shù)固定在聚砜/多壁碳納米管（multlwalled carbon nanotubes，MWCNT）/二茂鐵（ferrocene，F(xiàn)c）膜中，膜沉積到絲網(wǎng)印刷電極上制備電化學(xué)生物傳感器。生物胺在DAO存在下被催化為過氧化氫、氨氣和醛類物質(zhì)，其中過氧化氫電化學(xué)氧化產(chǎn)生電子，進(jìn)而產(chǎn)生電流，在電極表面檢測(cè)到電信號(hào)的變化量代表生物胺含量。張敏等[67]將變性血紅蛋白（unfolded hemoglobin，uHb）固定在黏土-納米 金復(fù)合材料修飾的電極表面，戊二醛作為交聯(lián)劑固定DAO。通過測(cè)定電流值確定尸胺濃度。該方法的uHb與其他過氧化酶相比對(duì)H2O2的催化能力更強(qiáng)，提高了靈敏度，對(duì)尸胺的檢出限為6.7×10-13mol/L。這些方法雖然操作簡(jiǎn)便、靈敏度較高，但存在固定化膜不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。Hooda等[68]將多胺氧化酶和DAO固定在殼聚糖/椰子纖維/氧化鋅納米條上進(jìn)行水果和蔬菜中精胺、亞精胺和腐胺的檢測(cè)。高拉伸強(qiáng)度的椰子纖維增強(qiáng)了膜的穩(wěn)定性，加入氧化鋅納米顆粒的固定化膜中的酶活性保留率和酶載量也大大增加。該方法提高了膜的穩(wěn)定性和酶活性，為應(yīng)用到檢測(cè)水產(chǎn)品生物胺提供了一定的思路。

結(jié)合相關(guān)研究結(jié)果，目前，生物傳感器因其高性能、低成本和小型化等優(yōu)點(diǎn)在現(xiàn)有的生物胺檢測(cè)方法中處于領(lǐng)先地位，基于酶促反應(yīng)的酶生物傳感器將酶的選擇性與目標(biāo)分析物的鑒定結(jié)合起來，將生物催化反應(yīng)的產(chǎn)物量直接轉(zhuǎn)化為光、電信號(hào)從而實(shí)現(xiàn)生物胺快速和準(zhǔn)確的檢測(cè)。然而，酶生物傳感器中存在酶的固定化不穩(wěn)定和催化效率低等問題，影響傳感器的穩(wěn)定性和靈敏度。因此研制新型固定化膜和更高效的催化物質(zhì)并將其用于制備生物傳感器，實(shí)現(xiàn)固定化酶的更穩(wěn)定和更高的反應(yīng)效率是目前的研究趨勢(shì)?；诿复俜磻?yīng)的生物傳感器在檢測(cè)水產(chǎn)品生物胺中應(yīng)用的總結(jié)見表7。

表7 基于酶促反應(yīng)檢測(cè)水產(chǎn)品中的生物胺Table 7 Recent literature on enzymatic detection of biogenic amines in aquatic products

3.4 基于酸堿度變化檢測(cè)水產(chǎn)品中的生物胺

pH指示劑是指示酸堿變化最直接、最常用的物質(zhì)，如花青素、甲基紅、姜黃素、溴甲酚綠、溴酚藍(lán)等。生物胺是一類低分子質(zhì)量堿性含氮化合物的總稱，因此可以利用生物胺的堿性性質(zhì)進(jìn)行水產(chǎn)品生物胺的定性和定量（表8）。翟曉東[72]將對(duì)pH值敏感的姜黃素?fù)饺氲兔芏染垡蚁┲校ㄟ^熔融擠出吹膜法制備成比色膜檢測(cè)鰱魚中的揮發(fā)性生物胺。當(dāng)遇到堿性生物胺后，薄膜呈現(xiàn)從黃色至棕色的變化。這些pH指示劑雖然可以檢測(cè)出生物胺的存在，但只能提供半定量信息和較低的靈敏度。Siripongpreda等[73]將pH敏感型染料溴甲酚紫采用吸附法固定在多孔聚乳酸基質(zhì)上制成比色傳感器，與以氧化石墨烯作為基底的激光解吸電離質(zhì)譜聯(lián)用建立雙重檢測(cè)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)生物胺的定性和定量。遇到堿性生物胺后可直觀快速觀察到比色傳感器從黃色變成紫色；在另一層上，以氧化石墨烯作為基底的激光解吸電離質(zhì)譜通過相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)生物胺進(jìn)行定量，對(duì)腐胺和尸胺的檢出限分別為0.07 pmol/L和0.02 pmol/L。比色傳感器的簡(jiǎn)便快速與激光解吸電離質(zhì)譜的高靈敏度為直觀、準(zhǔn)確檢測(cè)食品中的生物胺提供了保障，但該方法需要昴貴和復(fù)雜的設(shè)備。Guo Lingling等[74]設(shè)計(jì)了一種由20 種不同比例的殼聚糖納米顆粒-染料/醋酸纖維素組成的比色條形碼檢測(cè)魚肉、雞肉和牛肉中的生物胺含量等新鮮度指標(biāo)。當(dāng)條形碼暴露于不同濃度的不同生物胺氣體時(shí)，條形碼中染料的生色團(tuán)會(huì)根據(jù)酸堿度變化而改變顏色。以溴百里酚藍(lán)為例，遇到堿性生物胺后，條形碼從黃色變成藍(lán)色。為了更加實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)肉品的新鮮度，他們采用深度卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（deep convolutional neural networks，DCNN）系統(tǒng)對(duì)比色條形碼進(jìn)行學(xué)習(xí)、識(shí)別和處理，從而形成了肉品新鮮度的DCNN評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)集并將DCNN數(shù)據(jù)集上傳到云端中，該方法通過使用智能手機(jī)應(yīng)用程序界面可實(shí)時(shí)快速地監(jiān)控肉品新鮮度，總體預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為98.5%（圖4）。

表8 基于酸堿度變化檢測(cè)水產(chǎn)品中生物胺Table 8 Recent literature on detection of biogenic amines in aquatic products based on pH response

圖4 人類對(duì)氣味分子的感知和比色條碼結(jié)合DCNN系統(tǒng)的模仿嗅覺系統(tǒng)對(duì)生物胺等新鮮度指標(biāo)檢測(cè)原理圖[74]Fig.4 Principle diagram of human perception of odor molecules and colorimetric bar code combined with deep convolutional neural network to simulate olfactory system for the detection of bioamines and other freshness indicators[74]

采用酸堿性敏感的指示劑可以檢測(cè)生物胺，但存在顏色分辨率低的問題。因此利用酸堿性變化引起能量轉(zhuǎn)移或結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致顏色變化等原理檢測(cè)生物胺也是近年來研究的熱點(diǎn)。Χu Χiaoyu等[75]將甲基紅與鑭系金屬有機(jī)框架共價(jià)結(jié)合制備成生物胺傳感器。該傳感器有兩個(gè)發(fā)射中心，利用pH值誘導(dǎo)能量轉(zhuǎn)移原理，甲基紅熒光增加，Eu3+熒光強(qiáng)度降低，從而表現(xiàn)出明顯顏色變化。該傳感器的高量子產(chǎn)率和有序孔結(jié)構(gòu)提高了傳感器的靈敏度，對(duì)組胺的檢出限為0.1 μmol/L。Lin Tianran等[76]將AuNPs、間苯二酚單乙酸鹽（resorcinol monoacetate，RMA）和硝酸銀（AgNO3）固定在瓊脂糖凝膠中制備了一種傳感器。堿性生物胺引起RMA水解生成還原產(chǎn)物，還原AgNO3產(chǎn)生金屬銀附在AuNPs表面導(dǎo)致納米粒子 長(zhǎng)寬比和表面組成發(fā)生變化，從而使局域表面等離子體共振吸收峰發(fā)生藍(lán)移，AuNPs出現(xiàn)明顯顏色變化，對(duì)三甲胺的檢出限為8.6×10-9mol/dm3。

前期研究結(jié)果表明，基于酸堿度變化導(dǎo)致顏色變化檢測(cè)生物胺是最直接和直觀的檢測(cè)方法，但基于這類原理檢測(cè)生物胺只能提供定性和半定量信息，靈敏度和特異性較低。因此，根據(jù)酸堿度變化引起其他變化（能量轉(zhuǎn)移或結(jié)構(gòu)變化等）從而提供生物胺的定性和定量信息是目前的研究趨勢(shì)。同時(shí)，將基于酸堿度變化導(dǎo)致顏色變化與DCNN等數(shù)學(xué)模型聯(lián)用可為提高靈敏度和準(zhǔn)確度提供一定的技術(shù)支撐。

4 結(jié) 語

水產(chǎn)品因自身的營(yíng)養(yǎng)特性，容易滋生微生物而導(dǎo)致腐敗變質(zhì)，這一過程會(huì)產(chǎn)生大量生物胺。過量攝入生物胺會(huì)對(duì)人體健康構(gòu)成潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)，因此準(zhǔn)確快速地檢測(cè)水產(chǎn)品中生物胺含量對(duì)于水產(chǎn)品行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展以及保障水產(chǎn)品食用安全至關(guān)重要。雖然隨著研究的深入，各種檢測(cè)技術(shù)的準(zhǔn)確性和靈敏度都有了很大的提高，但如何快速準(zhǔn)確和特異性檢測(cè)水產(chǎn)品中的生物胺仍是本領(lǐng)域面臨的難題。本綜述對(duì)檢測(cè)方法原理進(jìn)行分類討論并對(duì)其優(yōu)缺點(diǎn)和發(fā)展方向進(jìn)行總結(jié)，旨在通過對(duì)原理創(chuàng)新并結(jié)合新的技術(shù)手段應(yīng)用于今后水產(chǎn)品生物胺的檢測(cè)中，為水產(chǎn)品中生物胺的高效檢測(cè)提供參考，對(duì)保障水產(chǎn)品品質(zhì)和安全、助力大健康背景下健康中國(guó)和食品安全國(guó)家戰(zhàn)略具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。