梁曾恩妮，汪秋安，張菊華，蘇東林，付復(fù)華，李高陽(yáng)，劉 偉,*，單 楊,*

（1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2.果蔬貯藏加工與質(zhì)量安全湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125；3.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410082）

血管內(nèi)皮細(xì)胞呈扁平形或多角形，通過(guò)黏附連接、緊密連接和縫隙連接的方式在血管以及淋巴管內(nèi)表面形成單層細(xì)胞，起到調(diào)節(jié)血管張力、細(xì)胞屏障等作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能失調(diào)導(dǎo)致血管功能削弱，從而引起高血壓、冠心病、心肌梗塞、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管性疾病[1]。自由基是細(xì)胞代謝的中間產(chǎn)物或副產(chǎn)物，是維持生命所必需的，具有信號(hào)傳導(dǎo)、預(yù)防微生物感染、激活細(xì)胞活性等多種生理功能[2]。然而，過(guò)剩的自由基利用氧化作用攻擊健康細(xì)胞的不飽和脂肪酸和蛋白質(zhì)，引起脂質(zhì)、代謝酶系、蛋白質(zhì)和DNA等物質(zhì)氧化，還會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞和機(jī)體衰老、損傷或死亡。氧自由基的產(chǎn)生和清除失衡誘發(fā)的氧化應(yīng)激是損傷血管內(nèi)皮的主要病理因素之一[3]。近年來(lái)，自由基對(duì)人體的危害備受重視，開(kāi)發(fā)具有清除自由基功能的食品和天然抗氧化劑成為學(xué)者研究的重要內(nèi)容。黃酮類化合物能夠調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的自由基水平和增強(qiáng)機(jī)體的氧化防御能力，是天然抗氧化劑的重要來(lái)源[4]。柑橘是世界第一大水果和重要的天然黃酮化合物來(lái)源，其消費(fèi)量呈穩(wěn)定上升趨勢(shì)[5]。由于黃酮化合物具有抑制羥自由基和提供氫原子的能力，因此它們具有抗氧化能力，是極佳的羥自由基清除劑。

圣草次苷是一種存在于檸檬或酸橙柑桔中的黃烷酮，具有抗氧化、抗癌和抗過(guò)敏等多種生物活性[6]。國(guó)內(nèi)對(duì)圣草次苷活性功能的報(bào)道較少，僅有張曉愉等[7]采用圣草次苷治療小鼠慢性帕金森疾病。他們發(fā)現(xiàn)圣草次苷可以通過(guò)小鼠神經(jīng)元細(xì)胞的死亡緩解1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶誘導(dǎo)的小鼠慢性帕金森疾病。國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道圣草次苷還具有其他生理功能。例如，圣草次苷可以通過(guò)上調(diào)p53、細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白D3和周期素依賴性激酶6抑制S期細(xì)胞周期，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[8]；食用圣草次苷（32 mg/（kgmb·d））28 d可以增加線粒體大小和線粒體DNA含量，改善血脂異常和高脂飲食引起的肝脂肪變性[9]。圣草次苷和白藜蘆醇聯(lián)合可抑制體外脂多糖誘導(dǎo)的一氧化氮（NO）、腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素1β的分泌，減輕體內(nèi)12-O-十四烷酰佛波-13-乙酸酯引起的水腫和皮下組織炎癥[10]。Miyake等[11]使用亞油酸體系評(píng)估圣草次苷抗氧化活性發(fā)現(xiàn)，圣草次苷在亞油酸自氧化系統(tǒng)中的抗氧化活性與α-生育酚相當(dāng)，與檸檬酸共同使用時(shí)抗氧化活性增強(qiáng)。

然而，圣草次苷在枳殼或新鮮檸檬或酸橙中的含量很低，其含量約為柚皮苷、新橙皮苷等柑橘黃酮含量的1/40[12]。企業(yè)多利用檸檬自然生理落果和多步法提取圣草次苷，即檸檬等柑橘落果經(jīng)乙醇提取、樹(shù)脂分離以及體積分?jǐn)?shù)75%、85%和95%的乙醇溶劑3 步純化精制，不僅提取效率極低（≤1%），而且產(chǎn)品純度在10%以內(nèi)，加工流程繁瑣、成本高[13]。而圣草次苷化學(xué)合成法使用較少，這種方法可以采用來(lái)源豐富、含量高、價(jià)格相對(duì)低廉的天然二氫黃酮類資源橙皮苷制備圣草次苷，工藝簡(jiǎn)單可控，不僅簡(jiǎn)化了生產(chǎn)流程，降低了成本，而且提高了產(chǎn)率和純度。本實(shí)驗(yàn)采用橙皮苷結(jié)構(gòu)修飾合成圣草次苷，對(duì)分離純化后的目標(biāo)產(chǎn)物通過(guò)1H核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）和13C NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，以過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）作為體外細(xì)胞氧化損傷模型，研究圣草次苷的細(xì)胞毒性作用及其對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞保護(hù)作用，評(píng)價(jià)圣草次苷的抗氧化潛力，為其開(kāi)發(fā)和利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橙皮苷（純度≥98%） 綿陽(yáng)迪澳藥業(yè)有限公司；HUVEC細(xì)胞 上海中喬新舟生物科技有限公司；CCK-8（cell counting kit-8）試劑盒 日本同仁化學(xué)研究所；DMEM培養(yǎng)基 美國(guó)Sigma公司；胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS） 美國(guó)Gibco公司；胰酶消化液、雙抗（青鏈霉素）、BCA法蛋白定量檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所；Super ECL Plus超敏發(fā)光液 美國(guó) Advansta公司；一抗Bax、Bcl-2、p53、β-actin 美國(guó)Proteintech公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BSC-1300IIA2超凈工作臺(tái) 蘇凈安泰科技有限 公司；Forma Series II CO2培養(yǎng)箱、5424離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；LDZΧ-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋 上海 申安醫(yī)療器械廠；LGJ-12D真空冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；AS200.R2電子天平 波蘭 RADWAG公司；Avanti J-26 ΧP高速冷凍離心機(jī)、Cytoflex流式細(xì)胞儀 美國(guó)Beckman公司；MK3酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；CKΧ41SF熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司；ZWY-100D振蕩搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；JB-10磁力攪攔器 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 圣草次苷制備工藝

將100 g干燥橙皮苷加入由900 mL吡啶溶劑和0.6 g三氯化鋁催化劑組成的混合溶液中，在（90±5）℃條件下反應(yīng)12 h。真空減壓回收吡啶，加入550 mL蒸餾水?dāng)嚁r均勻成浸膏。待浸膏溫度低于30 ℃，加入500 mL體積分?jǐn)?shù)10%鹽酸水解鋁鹽2 h，冷卻至常溫，用活性炭20 g脫色，脫色液上樣至大孔樹(shù)脂柱（高度1 m、內(nèi)徑0.06 m），用3 倍體積的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液洗滌該樹(shù)脂柱至流出液無(wú)色，濃縮洗脫液，采用3 倍體積的體積分?jǐn)?shù)85%乙醇溶液攪攔溶解3 h，過(guò)濾，收集濾液，減壓蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥并粉碎，得到淡黃色固體。圣草次苷制備工藝流程見(jiàn)圖1。

圖1 圣草次苷制備工藝流程Fig.1 Flow chart for the preparation process of eriocidin

1.3.2 合成化合物結(jié)構(gòu)測(cè)定

對(duì)所合成化合物的結(jié)構(gòu)通過(guò)1H NMR和13C NMR進(jìn)行表征，均采用四甲基硅烷作內(nèi)標(biāo)，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）-d6作溶劑，1H NMR檢測(cè)頻率400 MHz，13C NMR檢測(cè)頻率101 MHz。

1.3.3 HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)

在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下，HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基（含100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素）中，每2～3 d更換培養(yǎng)液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 圣草次苷和H2O2對(duì)HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)影響的分析

采用CCK-8法檢測(cè)圣草次苷和H2O2對(duì)HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC細(xì)胞，胰酶消化計(jì)數(shù)后，以5×103個(gè)/孔密度接種于96 孔板內(nèi)。培養(yǎng)12 h后，加入不同濃度H2O2（終濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol/L）或不同質(zhì)量濃度圣草次苷（終質(zhì)量濃度為50、100、200、400 μg/mL）分別在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑孵育4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（optical density，OD）值。設(shè)空白組（僅培養(yǎng)基）和正常組（無(wú)藥物處理的細(xì)胞），細(xì)胞存活率按下式計(jì)算。

1.3.5 圣草次苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)的保護(hù) 作用分析

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔密度接種于96 孔板內(nèi)，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h，分別加入0.4 mol/L H2O2或/和不同質(zhì)量濃度圣草次苷（50、100、200 μg/mL）。設(shè)正常對(duì)照組（無(wú)藥物處理的細(xì)胞），僅添加H2O2處理作為模型組，同時(shí)添加H2O2和圣草次苷處理作為干預(yù)組，分別記作ERI-50、ERI-100和ERI-200組。培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑孵育4 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，按1.3.4節(jié)公式計(jì)算細(xì)胞存活率，根據(jù)細(xì)胞存活率評(píng)價(jià)圣草次苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)的保護(hù)作用。

細(xì)胞經(jīng)過(guò)相應(yīng)藥物處理后，每組處理在熒光倒置顯微鏡100 倍亮視野下觀察并拍照。

1.3.6 圣草次苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞內(nèi)ROS水平 影響的分析

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC細(xì)胞接種于6 孔板中，接種密度為1×105個(gè)/mL，每孔2 mL，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h，分別加入0.4 mol/L H2O2和不同質(zhì)量濃度圣草次苷（50、100 μg/mL），設(shè)正常對(duì)照組（無(wú)藥物處理的細(xì)胞）。按照1∶1 000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋ROS探針2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA），使其終濃度為10 μmol/L。吸去細(xì)胞中的細(xì)胞培養(yǎng)液，加入1 mL 10 μmol/L DCFH-DA，37 ℃、5% CO2孵育20 min，用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次，用胰酶消化收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的ROS水平。ROS水平以DCFH熒光強(qiáng)度表示。

1.3.7 圣草次苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞MDA水平 和抗氧化物酶系活力影響的分析

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC細(xì)胞接種于6 孔板中，接種密度為1.0×105個(gè)/mL，每孔2 mL，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h，分別加入0.4 mol/L H2O2和不同質(zhì)量濃度圣草次苷（50、100 μg/mL），設(shè)空白組（僅培養(yǎng)基）和正常組（無(wú)藥物處理的細(xì)胞）。吸去細(xì)胞培養(yǎng)液后，用pH 7.4磷酸緩沖液清洗細(xì)胞3 次，加入100 μL RIPA細(xì)胞裂解液，1 500×g、4 ℃離心10 min，收集上清液待測(cè)。按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定MDA含量及SOD、CAT、GSH-Px活力（均以每毫克蛋白計(jì)）。

1.3.8 圣草次苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞蛋白表達(dá)影響的分析

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC細(xì)胞接種于6 孔板中，接種 密度為1×105個(gè)/mL，每孔2 mL，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h，按1.3.7節(jié)分組方法加藥處理和裂解細(xì)胞后，將裂解液離心，收集上清液，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%分離膠和5%濃縮膠，上樣，分離目的蛋白，采用半干法將目的蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，將PVDF膜放入抗體Bax（體積比1∶5 000稀釋）、Bcl-2（體積比1∶500稀釋）和p53（體積比1∶1 000稀釋）稀釋液中4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗室溫孵育1 h，暗室中加入超敏發(fā)光液1 mL與膜孵育1 min，吸進(jìn)液體，曝光顯影，采用ImageJ軟件進(jìn)行定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 24軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，采用Tukey法進(jìn)行組間差異比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 圣草次苷的合成及表征結(jié)果

以來(lái)源豐富、價(jià)廉的天然二氫黃酮類資源橙皮苷為原料，經(jīng)吡啶在三氯化鋁催化下發(fā)生去甲基反應(yīng)得到圣草次苷（圖2）。常規(guī)提取工藝需經(jīng)過(guò)不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液純化3 次，本研究?jī)H需通過(guò)樹(shù)脂分離、乙醇純化1 次，再經(jīng)過(guò)濾和干燥，即可得到圣草次苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%～98%的成品，與常規(guī)多步法提取相比，合成時(shí)間由常規(guī)提取的72 h縮短至48 h，產(chǎn)率由一般常規(guī)提取的40%～60%提高至75%以上，產(chǎn)品純度由常規(guī)提取的70%～80%提高至80%～98%[14]。

圖2 圣草次苷合成的反應(yīng)式Fig.2 Chemical reaction for synthesis of eriocidin

圣草次苷：黃色固體，產(chǎn)率83%，熔點(diǎn)為161～164 ℃。如圖3所示，圣草次苷1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：12.06（s, 1H, 5-OH）、9.14（s, 1H, 4’-OH）、9.09（s, 1H, 3’-OH）、6.92（dd, 1H,J＝ 8.5, 2.5 Hz, 6’-H）、6.82（d, 1H,J＝2.5 Hz, 2’-H）、6.78（d, 1H,J＝8.5 Hz, 5’-H）、6.17（d, 1H,J＝ 2.3 Hz, 8-H）、6.14（d, 1H,J＝2.4 Hz, 6-H）、5.46（d,J＝ 12.5 Hz, 1H, 2-H）、5.24（d,J＝7.2 Hz, 1H, 1’’-H）、5.01（d,J＝2.5 Hz, 1H, 1’’’-H）、4.75～3.15（m, 15H, 2”, 3”, 4”, 5”, 6”, 2’’’, 3’’’, 4’’’, 5’’’ -H）、3.12（dd,J＝ 16.5, 12.6 Hz, 3a-H）、2.75（dd,J＝16.5, 3.0 Hz, 3b-H）、1.11（d,J＝6.0 Hz, 3H, CH3）；圣草次苷13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ：197.61（4-C）、165.53（7-C）、163.50（5-C）、163.08（9-C）、146.24（4’-C）、145.64（3’-C）、129.74（1’-C）、118.50（6’-C）、115.88（2’-C）、114.89（5’-C）、101.06（10-C）、96.78（1’’’-C）、96.05（1’’-C）、79.15（6-C）、 79.06（8-C）、76.73（2-C）、75.97（3’’-C）、73.46 （5’’-C）、72.54（2’’-C）、71.20（4’’-C）、70.73（3’’’-C）、 70.0（2’’’-C）、68.78（4’’-C）、66.51（5’’’-C）、 60.23（6’’-C）、42.75（3-C）、18.28（6’’’-C）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15-16]報(bào)道基本一致，故鑒定合成化合物為圣草次苷。

圖3 化學(xué)合成圣草次苷的1H NMR（A）和13C NMR（B）譜圖Fig.3 1H NMR (A) and 13C NMR (B) spectra of the synthetic eriocidin

2.2 圣草次苷對(duì)HUVEC細(xì)胞的毒性作用及其對(duì)H2O2 誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)的保護(hù)作用

CCK-8是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)方法，其檢測(cè)原理為2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯作用下被細(xì)胞線粒體中脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物，在450 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰[17]。由圖4A可知，與正常組（圣草次苷質(zhì)量濃度0 μg/mL）相比，不同質(zhì)量濃度圣草次苷作用HUVEC細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率顯著增加 （P＜0.05），其中50 μg/mL圣草次苷促細(xì)胞生長(zhǎng)效果最好，隨圣草次苷質(zhì)量濃度的增加，促生長(zhǎng)作用有所減弱。結(jié)果表明，50～400 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的圣草次苷對(duì)HUVEC細(xì)胞無(wú)毒性作用。因此，選取50、100、200 μg/mL圣草次苷研究其對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

圖4 H2O2和圣草次苷對(duì)HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of H2O2 and eriocitrin on the growth of HUVEC cells

氧化應(yīng)激是一種自由基積累過(guò)多導(dǎo)致的負(fù)面作用，會(huì)使健康細(xì)胞損傷和死亡。細(xì)胞存活率是反映氧化還原失衡環(huán)境對(duì)細(xì)胞損傷和死亡程度的最直觀指標(biāo)，因此，細(xì)胞存活率下降是氧化應(yīng)激模型建立成功的重要標(biāo)志之一[18]。如圖4B所示，HUVEC細(xì)胞存活率隨著H2O2濃度的增加而降低，當(dāng)H2O2濃度不超過(guò)0.4 mol/L時(shí)，其對(duì)HUVEC細(xì)胞損傷不明顯，細(xì)胞存活率仍在80%以上；當(dāng)H2O2濃度為0.4 mol/L以上時(shí)，其對(duì)HUVEC細(xì)胞損傷明顯增強(qiáng)；當(dāng)H2O2濃度為1.4 mol/L時(shí)，細(xì)胞存活率低于40%，表明成功構(gòu)建了H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。本實(shí)驗(yàn)主要研究圣草次苷在自然衰老模型中對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，H2O2濃度太高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷嚴(yán)重難以恢復(fù)，因此，選取0.4 mol/L H2O2刺激HUVEC細(xì)胞建立氧化損傷模型。

由圖4C可知，與模型組相比，50、100、200 μg/mL圣草次苷處理均可顯著提高細(xì)胞存活率（P＜0.05），100 μg/mL圣草次苷對(duì)H2O2致HUVEC細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用最強(qiáng)，但劑量效應(yīng)不明顯。這與細(xì)胞形態(tài)學(xué)所觀察到的結(jié)果一致（圖5）。正常組HUVEC細(xì)胞呈棱形，貼壁緊密，生長(zhǎng)良好；H2O2處理后細(xì)胞皺縮，呈圓形或橢圓形，且貼壁不緊密，與正常組相比，細(xì)胞 間距增加，細(xì)胞數(shù)量明顯減少。不同質(zhì)量濃度圣草次苷 與H2O2同時(shí)處理HUVEC細(xì)胞24 h后，大多細(xì)胞呈棱形，形態(tài)正常，與模型組相比細(xì)胞數(shù)量明顯增多。綜合以上結(jié)果，選取50、100 μg/mL圣草次苷進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 圣草次苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞形態(tài)的影響（×100）Fig.5 Effect of eriocitrin on the morphology of HUVEC cells treated with H2O2 (× 100)

2.3 圣草次苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

ROS由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶、脂氧化酶或環(huán)氧化酶還原形成[19]。當(dāng)機(jī)體受到外界脅迫時(shí)，ROS可以作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)生物學(xué)和生理過(guò)程以緩解脅迫，細(xì)胞分化、組織再生和防止衰老等細(xì)胞過(guò)程都需要ROS作為氧化還原信號(hào)參與[20]。然而，高水平的ROS引起氧化還原狀態(tài)失衡及細(xì)胞DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)破壞[21]。 ROS探針DCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞后水解成DCFH，被細(xì)胞內(nèi)ROS氧化發(fā)出熒光，胞內(nèi)ROS水平與其熒光強(qiáng)度成正比。由圖6可知，與正常組相比，暴露在H2O2環(huán)境下HUVEC細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高（P＜0.05）；采用圣草次苷和H2O2共培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞，細(xì)胞的ROS水平較模型組顯著降低（P＜0.05），表明圣草次苷能通過(guò)阻止H2O2誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS水平升高，減輕ROS對(duì)HUVEC細(xì)胞造成的氧化損傷。

圖6 圣草次苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞ROS水平的影響Fig.6 Effect of eriocitrin on ROS level in HUVEC cells induced by H2O2

2.4 圣草次苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞MDA含量的影響

暴露于臭氧、氮氧化物、高氧和某些異質(zhì)生物等環(huán)境可能會(huì)促使生物膜的多不飽和脂肪酸脂質(zhì)過(guò)氧化，促進(jìn)MDA等脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生。細(xì)胞內(nèi)的MDA由細(xì)胞膜磷脂中類似的脂肪?；^(guò)氧化物分解而產(chǎn)生，也是前列腺素合成中環(huán)氧合酶反應(yīng)的產(chǎn)物[22]。由圖7可知，與正常組相比，H2O2刺激HUVEC細(xì)胞的MDA含量顯著上升（P＜0.05）；與模型組相比，50、100 μg/mL圣草次苷均顯著降低了氧化應(yīng)激模型細(xì)胞MDA含量的上升 （P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性。模型組MDA含量顯著升高表明HUVEC細(xì)胞受到H2O2刺激后，細(xì)胞膜發(fā)生嚴(yán)重脂質(zhì)氧化損傷；而圣草次苷顯著降低細(xì)胞MDA含量，表明圣草次苷能減輕H2O2引發(fā)的脂質(zhì)氧化作用，對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷。

圖7 圣草次苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞MDA含量的影響Fig.7 Effect of eriocitrin on MDA content in HUVEC cells induced by H2O2

2.5 圣草次苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞抗氧化物酶系 活力的影響

SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶組成了機(jī)體的抗氧化酶系，一旦機(jī)體氧化還原平衡失衡，抗氧化酶系統(tǒng)催化抗氧化反應(yīng)以抵御外界氧化應(yīng)激刺激原，避免組織和細(xì)胞遭受過(guò)氧化物損害[23]?？寡趸赶到y(tǒng)通過(guò)將能量代謝產(chǎn)生的電子傳遞給ROS發(fā)揮抗氧化活性。當(dāng)體內(nèi)氧化脅迫較弱時(shí)，抗氧化系統(tǒng)能有效發(fā)揮電子傳遞作用，使細(xì)胞完成抗氧化反應(yīng)。然而，當(dāng)細(xì)胞氧化脅迫較強(qiáng)，體內(nèi)ROS短期內(nèi)大量增加，細(xì)胞就需要通過(guò)外源抗氧化劑獲得更強(qiáng)的抗氧化能力[24]。由圖8可知，與正常組相比，模型組的GSH-Px、CAT、SOD活力顯著降低 （P＜0.05）；與模型組相比，50、100 μg/mL圣草次苷顯著抑制了H2O2引起的HUVEC細(xì)胞中GSH-Px、CAT、SOD活力的下降（P＜0.05），且呈明顯劑量效應(yīng)。結(jié)果表明，H2O2降低HUVEC胞內(nèi)抗氧化酶系活力，破壞了細(xì)胞的氧化應(yīng)激動(dòng)態(tài)平衡，從而引起細(xì)胞氧化損傷，HUVEC細(xì)胞氧化應(yīng)激模型構(gòu)建成功；而在圣草次苷與H2O2聯(lián)合培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞24 h后，細(xì)胞抗氧化物酶系活力的下降趨勢(shì)得到明顯緩解，表明圣草次苷能減輕H2O2對(duì)細(xì)胞抗氧化物酶系的破壞作用，提高了細(xì)胞的氧化應(yīng)激調(diào)控能力，從而減輕了細(xì)胞的氧化損傷。

圖8 圣草次苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞抗氧化物酶系活力的影響Fig.8 Effect of eriocitrin on the activity of antioxidant enzymes in HUVEC cells induced by H2O2

2.6 圣草次苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞Bax、Bcl-2和p53蛋白表達(dá)的影響

抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax在細(xì)胞凋亡過(guò)程中扮演重要角色，Bcl-2/Bax比值與細(xì)胞凋亡的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。p53蛋白可介導(dǎo)DNA損傷后發(fā)生的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，參與DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期運(yùn)行等活動(dòng)。正常細(xì)胞內(nèi)Bax和p53蛋白含量較低，Bcl-2蛋白含量較高。當(dāng)外界環(huán)境刺激損傷細(xì)胞DNA時(shí)，胞內(nèi)Bax和p53表達(dá)量上升，Bcl-2表達(dá)量下降，細(xì)胞努力自我修復(fù)損傷的DNA，若無(wú)法修復(fù)，細(xì)胞則發(fā)生死亡[25]。由圖9可知，與正常組相比，模型組的Bax和p53蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增加 （P＜0.05），Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，Bcl-2/Bax比值顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，50、100 μg/mL 圣草次苷處理組中Bax和p53蛋白表達(dá)量均顯著降低 （P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高，Bcl-2/Bax比值顯著升高（P＜0.05），具有劑量依賴效應(yīng)。

圖9 圣草次苷對(duì)HUVEC細(xì)胞中Bcl-2、Bax和p53蛋白表達(dá)的影響Fig.9 Effect of eriocitrin on Bax/Bcl-2 ratio and p53 protein expression in HUVEC cells

3 討 論

H2O2是一種重要的ROS分子，常作為體外氧化應(yīng)激損傷的造模藥物，氧化應(yīng)激引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動(dòng)脈粥樣硬化形成的重要發(fā)病機(jī)制之一，可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷和功能障礙[26-27]。本研究采用橙皮苷制備圣草次苷，構(gòu)建了HUVEC細(xì)胞H2O2氧化應(yīng)激損傷模型，研究圣草次苷對(duì)HUVEC細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，并對(duì)其抗氧化損傷作用機(jī)制進(jìn)行了探討。研究發(fā)現(xiàn)，圣草次苷明顯緩解了H2O2對(duì)HUVEC細(xì)胞造成的氧化損傷，這種保護(hù)作用至少可以持續(xù)24 h，且50～400 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)圣草次苷對(duì)HUVEC細(xì)胞沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性作用，表明圣草次苷具有較好的預(yù)防和治療內(nèi)皮細(xì)胞損傷的潛力。

ROS屬于體內(nèi)高活性分子，可由機(jī)體新陳代謝產(chǎn)生，過(guò)量的ROS會(huì)升高脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA水平。機(jī)體抗氧化酶（SOD、CAT和GSH-Px）是人體抗氧化天然防御系統(tǒng)的重要組成部分[28]。本研究結(jié)果顯示，圣草次苷可明顯降低H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激HUVEC細(xì)胞的ROS水平和MDA含量，提高GSH-Px、SOD和CAT活力，提示圣草次苷可以提高機(jī)體清除氧自由基效率和抗氧化能力，減輕HUVEC細(xì)胞受到氧化應(yīng)激損傷。

細(xì)胞氧化還原狀態(tài)也是細(xì)胞凋亡執(zhí)行的“開(kāi)關(guān)”。促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的主要參與者和解碼者，通過(guò)調(diào)節(jié)氧化還原平衡狀態(tài)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞凋亡的控制[29]。在氧化應(yīng)激條件下，p53蛋白能夠與線粒體基質(zhì)中的親環(huán)素D形成復(fù)合物，使線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔打開(kāi)，引起線粒體內(nèi)容物釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死[30]。一般，p53與Bax的表達(dá)變化趨勢(shì)一致。抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，但同時(shí)抑制Bax和p53表達(dá)。然而，也存在p53與Bax表達(dá)水平不一致的特殊情況，例如，抗氧化劑二硫代氨基甲酸吡咯烷促進(jìn)Bax表達(dá)以抵抗Bcl-2的作用，而對(duì)p53的影響較小[31]。本研究采用Western blotting法分析HUVEC細(xì)胞中Bax、Bcl-2和p53蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明，模型組中H2O2能下調(diào)Bcl-2表達(dá)和Bcl-2/Bax比值，上調(diào)p53和Bax蛋白表達(dá)；與模型組相比，圣草次苷能上調(diào)Bcl-2表達(dá)和Bcl-2/Bax比值，下調(diào)p53和Bax蛋白表達(dá)，說(shuō)明圣草次苷對(duì)p53與Bax蛋白表達(dá)的影響趨勢(shì)基本一致。綜上所述，圣草次苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與提高自由基清除能力和抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用的合成方法能有效簡(jiǎn)化傳統(tǒng)圣草次苷提取純化工藝，提高圣草次苷得率和純度。圣草次苷對(duì)氧化應(yīng)激損傷HUVEC細(xì)胞具有良好的保護(hù)作用，主要是通過(guò)降低細(xì)胞MDA含量、提高抗氧化酶系活力、上調(diào)Bcl-2/Bax 比值和下調(diào)p53表達(dá)來(lái)抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡。本研究為圣草次苷作為功能性營(yíng)養(yǎng)添加劑在心血管疾病防治中的應(yīng)用提供了理論參考。若將具有較好抗氧化作用且對(duì)HUVEC細(xì)胞無(wú)毒性作用的活性物質(zhì)與圣草次苷協(xié)同使用，可能會(huì)更好地緩解內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷。心血管疾病發(fā)生發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，需要進(jìn)一步采用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和驗(yàn)證性臨床實(shí)驗(yàn)探討圣草次苷對(duì)血管的保護(hù)作用。