姜允嘉，劉金艷，許賽君，王 洋，張 彬，成 鐘，許 揚(yáng)，謝 勇*

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

5’-肌苷酸（inosine 5’-monphosphate，IMP）是讓人體感知鮮味特性的主要物質(zhì)之一，具有呈味作用穩(wěn)定持久的優(yōu)點(diǎn)，容易分離提取，pH 7.5環(huán)境結(jié)晶的IMP為二鈉鹽。GB 2760—1996《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，IMP二鈉鹽可在各類(lèi)食品中按生產(chǎn)需要適量使用。添加5%～12% IMP二鈉鹽并與谷氨酸鈉混合使用，其呈味作用較單獨(dú)使用谷氨酸鈉高約8 倍，IMP二鈉鹽有“強(qiáng)力味精”之稱(chēng)，是日常生活中所用豆瓣醬、醬油、雞精等調(diào)味品的主要成分之一。在生物體內(nèi)，IMP是嘌呤核苷酸從頭合成途徑中最先合成的化合物，是合成腺苷酸基琥珀酸（S-AMP）、鳥(niǎo)苷酸等的前體[1]， 這些化合物具有調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、能量遷移、增殖、死亡和DNA、RNA合成等功能[2]。S-AMP是嘌呤核苷酸從頭合成途徑中IMP的下一個(gè)產(chǎn)物，也是一種天然胰島素分泌促進(jìn)劑[3]。王楠等[4]基于酶促動(dòng)力學(xué)，以IMP為原料實(shí)現(xiàn)了S-AMP大量合成；王洋等[5]研究發(fā)現(xiàn)S-AMP和一磷酸腺苷（adenosine 5’-monophosphate，AMP）活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）形成復(fù)合體后促進(jìn)AMPK活化，降低飲食誘導(dǎo)的高血脂癥小鼠肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積和血脂濃度，可作為治療非酒精性脂肪肝的先導(dǎo)化合物開(kāi)展成藥性研究。IMP和S-AMP均為AMP的分子結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，由此推測(cè)IMP可能也具有活化AMPK提高糖脂代謝效率而改善糖脂代謝紊亂疾病的功能，且IMP與AMP的分子結(jié)構(gòu)相似度高于S-AMP，因此，IMP可能較S-AMP更具有藥物或功能性食品的開(kāi)發(fā)前景。然而，目前鮮有相關(guān)研究成果報(bào)道。C57/KsJ-db/db（簡(jiǎn)稱(chēng)db/db）小鼠是一種長(zhǎng)期罹患嚴(yán)重糖尿病和高血脂癥的模式動(dòng)物。為深入了解IMP活化AMPK后引起小鼠等模式動(dòng)物的代謝變化規(guī)律并探討IMP是否具有保健功能或食品安全隱患，本研究對(duì)6 月齡自發(fā)性糖尿病db/db小鼠灌胃IMP 8 周，分析小鼠生理學(xué)指標(biāo)變化和作用機(jī)制，為全面理解IMP等嘌呤核苷酸的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)生物學(xué)領(lǐng)域研究證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、動(dòng)物與試劑

HepG2細(xì)胞由國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(tái)提供；大腸桿菌質(zhì)粒pET-21a由本實(shí)驗(yàn)室保存。

SPF級(jí)db/db小鼠和C57/BL/6j（簡(jiǎn)稱(chēng)C57）小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCΧK（京）2019-0001），在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所SPF動(dòng)物房?jī)?nèi)按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)程飼養(yǎng)和給藥（使用許可證號(hào)：SYXK（京）2017-0020，有效期2017年 6月16日至2022年6月16日）。

IMP（食品級(jí)） 希杰（聊城）生物技術(shù)有限公司；尿酸（uric acid，UA）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測(cè)試劑盒 美國(guó)Abcam公司；乙酰輔酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）、磷酸化ACC1（phospho-ACC1，p-ACC1）、p-ACC2、甘油三酯水解酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）、AMPK、p-AMPK等一抗 美國(guó)Cell-Signal Technology公司；二抗辣根過(guò)氧化物酶-山羊抗兔免疫球蛋白G（H+L）、 青霉素-鏈霉素 北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)電泳分離膠（聚丙烯酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%～12%遞增） 南京金瑞斯生物科技有限公司；PrimeScrip RT MasterMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix ExTaq實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒 日本Takara公司；DMEM低糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、0.25%胰蛋白酶（25 g胰蛋白酶溶于0.975 L的PBS） 美國(guó)HyClone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國(guó)Gibio Life Technologies公司；油酸、洛伐他汀等試劑 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；bodipy 493/503中性脂質(zhì)染色劑 美國(guó)Thermo Fisher公司；乙酰輔酶A含量測(cè)定試劑盒 上海索橋生物科技有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）紅色熒光染料MitoSOΧ Red 美國(guó)Molecular Probes公司；血糖儀及配套血糖試紙 美國(guó)Roche公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FortéBio型表面等離子共振（surface plasma resonance，SPR）儀 美國(guó)Pioneer公司；AU480型全自動(dòng)生化儀 美國(guó)Beckman公司；M1000型多功能連續(xù) 波長(zhǎng)分光光度計(jì) 瑞士Tecan公司；IΧ51型熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司；LightCycler? 96 SW 1.1型qPCR儀 美國(guó)Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)小鼠的藥物處理及分組

稱(chēng)取一定量IMP，配制為pH 7.5的飽和水溶液，置于4 ℃冰箱內(nèi)12 h重結(jié)晶，回收晶體，于70 ℃恒溫箱中干燥48 h，準(zhǔn)確稱(chēng)量，配制成50 mg/mL水溶液。

挑選6 月齡、空腹血糖濃度約15 mmol/L、體質(zhì)量52～64 g的雄性db/db小鼠，分為兩組，每組10 只。設(shè)定未給藥小鼠為模型組，另一組為給藥組，按劑量 50 mg/（kgmb·d）灌胃IMP溶液，連續(xù)給藥8 周。以月齡相同的雄性C57小鼠5 只作為正常對(duì)照組，全部小鼠均使用正常飼料喂養(yǎng)。給藥開(kāi)始后每隔7 d用電子天平稱(chēng)量小鼠體質(zhì)量，并測(cè)定小鼠空腹血糖濃度，每次測(cè)定前小鼠禁食12 h，剪尾法取血，將血糖試紙安裝在血糖儀中，添加約20 μL血液到血糖試紙的進(jìn)樣口內(nèi)，記錄血糖儀上顯示的血糖濃度。

1.3.2 小鼠生理學(xué)指標(biāo)測(cè)定

給藥8 周后，小鼠禁食16 h后進(jìn)行取樣。收集小鼠尿液，按照UA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)定UA濃度。采集小鼠血清，用相應(yīng)檢測(cè)試劑盒分別測(cè)定血清ALP、AST、ALT、LDH活力；用全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）濃度。

采集血樣后立即處死小鼠，取心臟、肝臟和腎臟，收集的小鼠器官用10%福爾馬林溶液固定后石蠟包埋，切片。肝組織切片用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后用油紅O復(fù)染，心肌切片分別用天狼猩紅和油紅O染色，腎臟組織切片分別用HE染色和過(guò)碘酸-希夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色后用顯微鏡觀察并拍照保存。剩余小鼠器官樣品于-80 ℃冰箱中凍存。

1.3.3 IMP與AMPKγ1亞基的分子互作分析

根據(jù)文獻(xiàn)[6]報(bào)道的蛋白質(zhì)表達(dá)和純化方法利用大腸桿菌質(zhì)粒pET-21a表達(dá)人源AMPKγ1亞基（NCBI參考序號(hào)：NP_002724.1）。室溫下利用SPR儀按照王洋等[5]的方法進(jìn)行IMP和AMPKγ1亞基相互作用分析。用分子對(duì)接方法預(yù)測(cè)IMP-AMPKγ1亞基復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)，以AMPK-AMP復(fù)合體結(jié)構(gòu)（PDB登錄號(hào)：4EAI）[6]為受體分子，利用Pymol軟件（http://www.pymol.org）確定AMPK結(jié)合部位中與小分子形成氫鍵的氨基酸。分別將AMPK結(jié)構(gòu)和小分子IMP導(dǎo)入Autodock分子對(duì)接軟件中，利用Autodock Tools計(jì)算Gasteiger電荷，添加原子類(lèi)型得到其坐標(biāo)文件，對(duì)配體小分子IMP加極性氫、計(jì)算電荷、確定扭矩中心、選擇可旋轉(zhuǎn)的鍵得到其坐標(biāo)文件。設(shè)定對(duì)接的格點(diǎn)參數(shù)文件，格點(diǎn)間距設(shè)置為0.375 ?，結(jié)合空間大小為40 ?×40 ?×40 ?，以保證配體完全處在酶活性中心范圍內(nèi)，然后設(shè)定對(duì)接參數(shù)文件，利用半柔性對(duì)接方法進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性計(jì)算，使用拉馬克遺傳算法，算法對(duì)接輪數(shù)設(shè)置為50，其他參數(shù)取默認(rèn)值，利用Autodock 4軟件計(jì)算出IMP-AMPK復(fù)合體的空間結(jié)構(gòu)。

1.3.4 肝臟蛋白免疫印跡分析

小鼠肝組織加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液，用手術(shù)剪盡量剪碎后用超聲波破碎細(xì)胞，離心取上清，采用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度，制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析樣品。按照Wu Chongming等[7]所述條件進(jìn)行蛋白免疫印跡分析。

1.3.5 qPCR分析脂質(zhì)代謝通路中蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量

提取各組小鼠肝組織的總RNA并測(cè)定其濃度，隨即使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA文庫(kù)。采用qPCR法測(cè)定脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）、脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）、肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1A（carnitine palmitoyltransferase 1A，CPT1A）、固醇酰輔酶A脫氫酶1（stearyl coenzyme A dehydrogenase 1，SCD1）的mRNA相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)體系：SYBR Premix ExTaqqPCR試劑盒中的Supermix試劑6.25 μL，正向引物、反向引物溶液（10 μmol/L）各0.25 μL，cDNA 200 ng，添加ddH2O至總體積12.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃變性10 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸30 s，擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)。選擇18S rRNA為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。擴(kuò)增基因引物由上海捷瑞生物技術(shù)公司合成，引物序列如表1所示。

表1 IMP與AMPKγ1亞基相互作用參數(shù)Table 1 Parameters of interaction between IMP and AMPKγ1 subunit

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for quantitative real-time polymerase chain reaction used in this study

1.3.6 IMP的體外降脂活性實(shí)驗(yàn)

5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中用含有1%青霉素-鏈霉素和10% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，鋪96 孔板，細(xì)胞數(shù)約為1×104個(gè)/孔，分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和給藥組。IMP、洛伐他汀和油酸溶液均用上述培養(yǎng)HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)基溶液配制。以100 μmol/L油酸100 μL誘導(dǎo)形成脂質(zhì)蓄積細(xì)胞，作為模型組。油酸造模同時(shí)給藥，加入100 μL的10 μmol/L IMP為給藥組，以加入100 μL的10 μmol/L洛伐他汀為陽(yáng)性對(duì)照組，于含有5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h后用100 μL的4%多聚甲醛固定細(xì)胞，加入100 μL 2 μmol/L bodipy 493/503染色，用熒光倒置顯微鏡觀察并記錄細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積情況。

HepG2細(xì)胞按上述方法分組并給藥處理后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入含5 μmol/L MitoSOΧ Red的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃避光培養(yǎng)30 min，用PBS清洗3 次，再加入DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞ROS蓄積情況。

1.3.7 乙酰輔酶A含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取小鼠心、肝組織，按照0.1 g組織加入1 mL RIPA裂解液，于冰浴下勻漿破碎細(xì)胞，4 ℃、16 000×g離心20 min，取上清液，待測(cè)。按照試劑盒所述方法配制工作液，取工作液92 μL和樣品溶液10 μL混勻后開(kāi)始計(jì)時(shí)，于混勻后20 s和80 s時(shí)測(cè)定反應(yīng)體系340 nm波長(zhǎng)處吸光度。乙酰輔酶A的總量按如下公式計(jì)算。

式中：A1、A2分別為混勻后20 s和80 s時(shí)反應(yīng)體系340 nm波長(zhǎng)處吸光度；m為組織樣品質(zhì)量/mg。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析、Tukey’s檢驗(yàn)或Newman-Kueuls檢驗(yàn)分析組間差異，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 IMP處理db/db小鼠的生理學(xué)指標(biāo)

由圖1可知，給藥期間模型組db/db小鼠體質(zhì)量高度顯著高于正常對(duì)照組C57小鼠（P＜0.001），且各組小鼠體質(zhì)量均無(wú)明顯變化（圖1A）。給藥前模型組db/db小鼠空腹血糖濃度（＞15 mmol/L）約為C57小鼠的3 倍，表明其患有嚴(yán)重的糖尿病，IMP給藥期間給藥組小鼠空腹血糖濃度較模型組小鼠顯著降低（P＜0.05），但依然為高血糖水平（＞10 mmol/L），可以認(rèn)為IMP降糖活性較弱（圖1B）。給藥結(jié)束后，正常對(duì)照組小鼠尿液中UA濃度最高，模型組小鼠次之，IMP給藥后db/db小鼠尿液UA濃度最低，但與模型組差異性不顯著（圖1C）。與模型組相比，給藥組小鼠血清TC濃度顯著升高（P＜0.05），HDL濃度極顯著升高（P＜0.01），TG和LDL濃度雖有所升高，但兩組間差異不顯著（圖1D）。由圖1E～H可知，與模型組相比，給藥組小鼠ALP、AST、ALT和LDH活力均顯著上升（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）。AST/ALT活力比值大于1，表明肝臟受到實(shí)質(zhì)損害[8]，ALP、LDH活力顯著升高，表明發(fā)生了肝硬化[9]。

圖1 IMP給藥結(jié)束后各組小鼠的生理學(xué)指標(biāo)Fig.1 Physiological indicators of mice in each group after IMP administration

Manne等[10]通過(guò)觀察小鼠肝組織形態(tài)發(fā)現(xiàn)，即使是C57小鼠，隨著年齡增長(zhǎng)肝組織也會(huì)出現(xiàn)脂質(zhì)蓄積，可能患有輕度非酒精性脂肪肝。由圖2可知，本實(shí)驗(yàn)中，與正常對(duì)照組C57小鼠相比，模型組db/db小鼠肝組織中呈現(xiàn)大量脂肪顆粒，表明微泡脂肪變性并發(fā)脂質(zhì)蓄積，脂肪肝程度明顯加重，而給藥組小鼠肝組織脂肪顆粒較模型組更多，此現(xiàn)象和小鼠血清脂質(zhì)含量的變化趨勢(shì) （圖1D）一致，表明IMP給藥后反而加重了db/db小鼠肝臟內(nèi)脂質(zhì)蓄積。對(duì)比各組小鼠心肌組織形態(tài)，天狼猩紅染色結(jié)果表明IMP未對(duì)心肌造成明顯損傷，油紅O染色結(jié)果表明模型組和給藥組小鼠心肌組織內(nèi)脂質(zhì)蓄積較正常對(duì)照組嚴(yán)重，IMP給藥后沒(méi)有發(fā)生明顯變化。腎臟組織HE染色結(jié)果表明，各組小鼠腎臟組織沒(méi)有發(fā)生明顯改變，而PAS染色結(jié)果顯示，IMP給藥后db/db小鼠腎小球內(nèi)有糖含量降低的現(xiàn)象，這與IMP有一定降糖效果一致。這些結(jié)果證明，IMP給藥后反而加重了db/db小鼠脂質(zhì)代謝紊亂癥狀，并造成了更嚴(yán)重的肝損傷，但對(duì)心臟和腎臟沒(méi)有造成損傷，血糖與UA濃度的降低表明對(duì)腎臟有保護(hù)作用[11]。以上研究結(jié)果顯示IMP損傷的靶器官為肝臟。

圖2 IMP給藥后各組小鼠肝臟、心臟和腎臟組織形態(tài)Fig.2 Histological morphology of liver, heart, and kidney in each group of mice after IMP administration

2.2 IMP-AMPK相互作用結(jié)果

SPR分析可顯示小分子和靶標(biāo)蛋白相互作用過(guò)程中靶蛋白分子質(zhì)量隨時(shí)間的變化，響應(yīng)值的變化趨勢(shì)可直觀顯示分子間結(jié)合和解離[7]。如圖3A所示，IMP和AMPKγ1亞基瞬間結(jié)合，在SPR整個(gè)測(cè)試周期（300 s）內(nèi)沒(méi)有顯示解離，這與S-AMP與AMPKγ1亞基相互作用時(shí)產(chǎn)生的SPR信號(hào)相似，但與AMP和AMPKγ1亞基相互作用產(chǎn)生的SPR信號(hào)[5]不同。由 表1可知，AMP與AMPKγ1亞基形成復(fù)合體的KD值為 （174±3）μmol/L，S-AMP與AMPKγ1亞基形成復(fù)合體的KD值為（12.0±0.2）μmol/L[5]，而IMP-AMPKγ1亞基復(fù)合體KD值為（211±4）μmol/L，明顯高于AMP和S-AMP，但I(xiàn)MP與AMPKγ1亞基結(jié)合后形成的復(fù)合體穩(wěn)定性仍較弱，但由于AMPKγ1亞基具有4 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)[12]， 每個(gè)位點(diǎn)都能與IMP實(shí)現(xiàn)瞬間結(jié)合和解離，因此宏觀來(lái)看，IMP和AMPKγ1亞基在一定時(shí)間內(nèi)能夠形成穩(wěn)定復(fù)合體，因此監(jiān)測(cè)到的響應(yīng)值與IMP濃度呈正相關(guān)。此外，分子對(duì)接計(jì)算結(jié)果顯示IMP結(jié)合在AMPKγ1亞基中AMP結(jié)合位點(diǎn)時(shí)的最佳結(jié)合能為-28.368 kJ/mol，得到的 IMP-AMPKγ1亞基復(fù)合體結(jié)構(gòu)中IMP的構(gòu)型與AMP-AMPKγ1復(fù)合體結(jié)構(gòu)中AMP構(gòu)型相同，且可能形成更多氫鍵 （圖3B），這些結(jié)果證明IMP和AMPK可以形成復(fù)合體。

圖3 IMP和AMPK的分子互作結(jié)果Fig.3 IMP interacted with AMPK

2.3 脂質(zhì)代謝通路中蛋白相對(duì)表達(dá)量

人體細(xì)胞內(nèi)AMPK是糖脂代謝通路中的關(guān)鍵蛋白，AMP或AMP結(jié)構(gòu)類(lèi)似物與AMPKγ亞基結(jié)合后，其α亞基Thr172位點(diǎn)被磷酸化，磷酸化的AMPK誘導(dǎo)活化糖、脂質(zhì)等代謝通路，AMPK的磷酸化水平反映了其活性的高低[13]。由圖4A～C可知，與模型組相比，IMP和AMPKγ亞基形成復(fù)合體可提高db/db小鼠肝臟細(xì)胞內(nèi)AMPK磷酸化水平，給藥組小鼠在AMPK活化的下游脂質(zhì)代謝通路中ATGL相對(duì)表達(dá)量與模型組相比也無(wú)顯著變化，表明肝臟細(xì)胞內(nèi)蓄積脂肪的分解沒(méi)有被促進(jìn)[14]，因此IMP不能促進(jìn)脂肪分解為脂肪酸。ACC包含ACC1和ACC2兩種亞型[15]， ACC1分布于胞質(zhì)中，可催化長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成[16]，ACC2分布于線粒體膜上，其磷酸化水平上升表明細(xì)胞內(nèi)脂肪酸氧化被促進(jìn)[17]。與模型組相比，IMP使小鼠肝臟總ACC表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01），ACC1和ACC2的磷酸化水平提高，由此可見(jiàn)，IMP和AMPK形成復(fù)合體后顯著提高小鼠肝臟內(nèi)脂肪酸氧化。

圖4 各組小鼠肝臟內(nèi)脂肪分解相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression levels of proteins related to lipolysis in mice

FASN、LPL、CPT1A和SCD1是脂質(zhì)代謝通路中的限速酶[18]。由圖4D～G可知，與模型組相比，IMP可顯著提高db/db小鼠CPT1A和SCD1mRNA表達(dá)量 （P＜0.05），CPT1A催化長(zhǎng)鏈脂肪酸由胞漿轉(zhuǎn)移到線粒體氧化[19]，SCD1催化飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為不飽和脂肪酸，促進(jìn)脂肪酸分解[20]，這兩種基因表達(dá)水平的增加表明IMP促進(jìn)了線粒體內(nèi)脂肪酸氧化。與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠FASN和LPLmRNA表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05），IMP給藥后db/db小鼠FASN和LPLmRNA表達(dá)量較模型組降低，但組間無(wú)顯著性差異。FASN催化乙酰輔酶A從頭合成棕櫚酸酯的全過(guò)程，是造成脂質(zhì)蓄積的重要蛋 白質(zhì)[21]，LPL催化TG水解[22]，二者mRNA表達(dá)量降低表明肝內(nèi)脂肪蓄積和分解被干擾，發(fā)生了更嚴(yán)重的脂質(zhì)代謝紊亂，這與IMP給藥后db/db血清中HDL和LDL濃度均高于模型組的結(jié)果一致。

2.4 IMP對(duì)脂質(zhì)蓄積HepG2細(xì)胞的降脂活性

通過(guò)熒光顯微鏡可以觀察10 μmol/L IMP和10 μmol/L 洛伐他汀給藥24 h后各組HepG2細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)和ROS蓄積情況。由圖5可知，bodipy 493/503染色結(jié)果表明，IMP組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積量明顯低于相同濃度的洛伐他汀。IMP能加速脂肪酸氧化，導(dǎo)致HepG2細(xì)胞內(nèi)脂肪加速分解為甘油和脂肪酸，脂肪酸用于滿(mǎn)足氧化代謝需求，因而體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察到IMP的降脂活性明顯高于洛伐他汀。MitoSOΧ Red染色結(jié)果顯示，對(duì)照組和模型組細(xì)胞紅色熒光無(wú)明顯差異，洛伐他汀作用后依稀可見(jiàn)微弱的紅色熒光，而IMP組可見(jiàn)明顯的紅色熒光，表明IMP增加了肝細(xì)胞ROS的生成。ROS產(chǎn)生的主要部位是線粒體[23]，由于IMP促進(jìn)脂肪酸加速氧化，細(xì)胞在應(yīng)激條件下產(chǎn)生過(guò)多的ROS以完成相應(yīng)氧化反應(yīng)，還原型輔酶II氧化酶和過(guò)氧化物酶被活化，進(jìn)一步增加了肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激[24]，線粒體穩(wěn)態(tài)降低并導(dǎo)致DNA損傷[25]，從而導(dǎo)致小鼠肝損傷。

圖5 IMP對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)和ROS蓄積的影響Fig.5 Fluorescence micrographs describing lipid and ROS accumulation in HepG2 cells treated by IMP

2.5 小鼠肝臟和心臟乙酰輔酶A含量

如圖6所示，正常對(duì)照組C57小鼠肝臟和心臟組織中乙酰輔酶A含量分別約為3 nmol/mg和6 nmol/mg，而模型組db/db小鼠肝臟和心臟內(nèi)乙酰輔酶A含量急劇降低，為無(wú)檢出狀態(tài)；與正常對(duì)照組相比，IMP處理后db/db小鼠肝臟乙酰輔酶A含量高度顯著升高（P＜0.001），約為其6 倍，心臟乙酰輔酶A含量較模型組明顯升高，但低于正常對(duì)照組，約為其50%。乙酰輔酶A是動(dòng)物體內(nèi)一種重要的代謝中間產(chǎn)物[26]。蛋白質(zhì)、糖、脂肪三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解代謝都會(huì)生成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A除進(jìn)入三羧酸循環(huán)最終代謝為CO2和H2O之外[27]，也是肝臟內(nèi)合成新的 脂肪、膽固醇和酮體的原料[28]。由于脂肪酸氧化分解的主要途徑是β-氧化，而β-氧化會(huì)產(chǎn)生乙酰輔酶A[29]，當(dāng)長(zhǎng)期罹患代謝綜合征小鼠肝臟內(nèi)三羧酸循環(huán)不足以消耗脂肪酸過(guò)度氧化產(chǎn)生乙酰輔酶A時(shí)，過(guò)剩的乙酰輔酶A被合成為T(mén)C和TG，表明小鼠脂代謝紊亂癥狀加劇惡化，同時(shí)引發(fā)血清HDL和LDL濃度升高，表明這種模式動(dòng)物肝臟內(nèi)的三羧酸循環(huán)效益顯著低下。此外，心臟自動(dòng)收縮的過(guò)程需要消耗大量能量，心肌細(xì)胞的三羧酸循環(huán)活性高于肝細(xì)胞，相對(duì)而言，心肌細(xì)胞內(nèi)IMP刺激產(chǎn)生的過(guò)剩乙酰輔酶A容易被徹底代謝為H2O和CO2，為心臟自主運(yùn)動(dòng)供給能量，不易發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，因此未觀察到小鼠心臟損傷。

圖6 給藥結(jié)束后各組小鼠的肝臟和心臟內(nèi)乙酰輔酶A含量Fig.6 Acetyl-CoA contents in liver and heart of mice in each group after IMP administration

3 討 論

AMPK是調(diào)控脂質(zhì)代謝的一種關(guān)鍵蛋白，能與其形成復(fù)合體提高其磷酸化水平的化合物都潛在具有提高脂質(zhì)代謝效益的功能，前期研究已發(fā)現(xiàn)S-AMP具有這一功能[5]，提示IMP可能也具有這樣的功能。IMP作為廣泛使用的食品添加劑，毒理學(xué)研究證明IMP滿(mǎn)足食品安全要求[30]，因此，本研究探索其作為新藥或保健食品的可行性。一般認(rèn)為AMPK的激動(dòng)劑能促進(jìn)脂質(zhì)代謝，降低受試動(dòng)物血清TG等水平，抵抗肝臟脂肪蓄積[2,5-6]，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IMP長(zhǎng)期作用于老齡db/db小鼠后，小鼠脂質(zhì)代謝紊亂癥狀更加惡化，血清TC濃度較模型組顯著升高（P＜0.05），可引發(fā)血管硬化，同時(shí)通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)還觀察到IMP促進(jìn)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。原因可能是老齡db/db小鼠體內(nèi)，尤其是骨骼肌內(nèi)三羧酸循環(huán)活性低下，IMP促進(jìn)脂肪酸氧化生成的乙酰輔酶A不能被徹底代謝為CO2和H2O，導(dǎo)致肝臟內(nèi)乙酰輔酶A含量較高。為抵抗乙酰輔酶A蓄積，肝臟產(chǎn)生氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量ROS以氧化分解乙酰輔酶A，造成了肝氧化應(yīng)激損傷；另一方面，乙酰輔酶A是合成TC、TG的原料，可導(dǎo)致體內(nèi)TC、TG過(guò)量合成，因而導(dǎo)致老齡db/db小鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂更加惡化。因此可推測(cè)，用IMP治療飲食誘導(dǎo)產(chǎn)生高血脂癥的青壯年小鼠，小鼠的高血脂癥可能得到改善，與S-AMP給藥后的效果[5]相似。今后應(yīng)開(kāi)展不同生長(zhǎng)周期的高血脂癥模型動(dòng)物體內(nèi)乙酰輔酶A代謝機(jī)制研究，從中發(fā)現(xiàn)非酒精性脂肪肝發(fā)病的新機(jī)制，并確定新的藥物作用靶標(biāo)，為篩選治療非酒精性脂肪肝的新藥奠定基礎(chǔ)。在實(shí)現(xiàn)AMPK活化的同時(shí)促進(jìn)乙酰輔酶A代謝，可能是研發(fā)治療非酒精性脂肪肝等脂質(zhì)代謝紊亂疾病藥物的新思路。

鑒于高齡db/db小鼠代謝綜合征的發(fā)生發(fā)展機(jī)制和長(zhǎng)期罹患糖尿病、高血脂癥等代謝綜合征的老年人相似，飲食中過(guò)多攝入IMP可能加重病情，由此建議對(duì)于患有代謝綜合征的老年人群應(yīng)減少?gòu)氖澄镏羞^(guò)度攝取IMP，同時(shí)盡快研究建立IMP的食品安全新標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定IMP食用范圍。加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能提高三羧酸循環(huán)，有助于降低乙酰輔酶A在肝臟內(nèi)的蓄積，可能降低IMP促進(jìn)體內(nèi)脂肪酸過(guò)度氧化對(duì)身體產(chǎn)生的損傷，綜上所述，本研究結(jié)果為清淡飲食和適當(dāng)運(yùn)動(dòng)有利于身體健康提供了新的科學(xué)依據(jù)。

綜上，IMP和AMPK形成復(fù)合體后可提高AMPK磷酸化水平，可顯著活化肝臟內(nèi)脂肪酸氧化通路。動(dòng)物體內(nèi)三羧酸循環(huán)活性低下時(shí)，在肝臟部位容易形成乙酰輔酶A蓄積，為抵抗乙酰輔酶A蓄積引發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)，肝臟產(chǎn)生ROS將其氧化分解和將其用于合成TG、TC等，在衰老動(dòng)物體內(nèi)造成肝氧化應(yīng)激損傷，并進(jìn)一步加劇脂質(zhì)代謝紊亂。