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        鹽酸克倫特羅檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

        2021-08-31 00:38:30李志娟李洪政閻永斌王永生
        河南畜牧獸醫(yī) 2021年14期
        關(guān)鍵詞:檢測(cè)方法

        李志娟,李洪政*,付 坤,閻永斌,王永生

        (1.河南國(guó)康檢測(cè)技術(shù)有限公司,河南 鄭州 450003;2.河南中德檢測(cè)技術(shù)有限公司;3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究所)

        鹽酸克倫特羅(clenbuterol,CLB),俗稱“瘦肉精”,是一類β-腎上腺素受體激動(dòng)劑化學(xué)物質(zhì)的總稱,該物質(zhì)為白色或類白色的結(jié)晶體粉末,味苦,熔點(diǎn)為161℃,溶于水、乙醇,微溶于丙酮,不溶于乙醚。當(dāng)瘦肉精進(jìn)入機(jī)體后,導(dǎo)致心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)運(yùn)行出現(xiàn)障礙,引起多種心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。動(dòng)物源性食品中瘦肉精是我國(guó)明令禁止的違禁藥品。因此,需要加強(qiáng)動(dòng)物性食品中的瘦肉精的檢測(cè),及時(shí)發(fā)現(xiàn)不合格的肉及肉制品,保障食品安全,對(duì)鹽酸克倫特羅的有效檢測(cè)和監(jiān)控刻不容緩。

        目前對(duì)鹽酸克倫特羅的檢測(cè)方法有感官檢驗(yàn)法、酸堿度法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、膠體金快速檢測(cè)卡(DIGFA)、毛細(xì)管電泳法(EC)、高效液相法(HPLC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、金磁納米粒子高靈敏定量(MGNPs)、中空纖維膜三相液相微萃取法(HF-LLLME)、光聲光譜法(PS)、液相芯片技術(shù)(LC-chip)等方法,其中朱小艾等采用高效液相色譜法對(duì)鹽酸克倫特羅的前處理和上機(jī)條件進(jìn)行優(yōu)化,但與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)相比,液質(zhì)方法耗時(shí)更短,定量更準(zhǔn)確。俞慧紅采用GC-MS的檢測(cè)方法,但其前處理過程需要通過提取-反萃取-凈化-柱后衍生的方式進(jìn)行,耗時(shí)較長(zhǎng)。(原)農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-18-2008《動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》采用了液質(zhì)的方法,但其前處理過程采用酶解較為復(fù)雜。故該研究擬在前人研究的基礎(chǔ)上,對(duì)樣品的前處理過程和上機(jī)條件進(jìn)行優(yōu)化,旨在為鹽酸克倫特羅的檢測(cè)提供一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的定量方法。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        1.1.1 豬肉、牛肉、羊肉 均采購(gòu)自菜市場(chǎng)。

        1.1.2 鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品 純度大于98.0%,德國(guó)Dr.EhrenstorferGmbH公司。

        1.1.3 乙酸乙酯、氨水、碳酸鈉 分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

        1.1.4 甲醇、甲酸、乙腈 色譜純,sigma。

        1.2 主要儀器與設(shè)備

        1.2.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源) 美國(guó)Waters公司W(wǎng)aters TQD。

        1.2.2 反向色譜柱 美國(guó)WatersUPLCTMBEHC18

        (2.1NN 100mm,1.7μm)。

        1.2.3 電子天平 BSA2202S-CW,感量0.01g,賽多利斯。

        1.2.4 分析天平 BT125D,感量0.00001g,賽多利斯。

        1.2.5 氮吹儀 WD1000,杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司。

        1.2.6 固相萃取裝置 ASE-12/16/24,天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

        1.2.7 高速冷凍離心機(jī) 熱電ThermoST8ST8R,Thermo Fisher。

        1.2.8 恒溫振蕩水浴搖床 MKY-SPH-110X12,麥科儀(北京)科技有限公司。

        1.2.9 渦旋混合器 88882010,ThermoFisher。

        1.3 方法

        1.3.1 試劑的配制

        5%氨化甲醇溶液:量取5mL氨水,加甲醇稀釋至100 mL,搖勻即得;0.1%甲酸溶液:量取水100mL,加入0.1mL甲酸,混勻;乙腈-0.1%甲酸溶液(5+95,V/V):量取乙腈5mL,加入0.1%甲酸溶液95mL,混勻;10%碳酸鈉水溶液:稱量10g碳酸鈉,溶于100mL水中,混勻;標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:稱取鹽酸克倫特羅約10.0mg,置于100mL量瓶?jī)?nèi),用甲醇溶解并稀釋成濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,-20℃冰箱中保存,有效期6個(gè)月。混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液:準(zhǔn)確量取鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置100mL量瓶中,用甲醇稀釋成濃度為20ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液。-20℃冰箱中保存,有效期6個(gè)月。

        1.3.2 試樣的制備與保存

        取適量新鮮的空白樣品和采購(gòu)的10份豬肉、牛肉、羊肉肌肉部分,分別混勻,-20℃以下貯存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3.3 質(zhì)量控制樣品的制備

        空白樣品:取空白試樣,與待測(cè)試樣同步處理。添加樣品:取空白試樣2i0.02g,添加20ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間工作液100μL,制得濃度為1μg/kg的陽(yáng)性添加試樣,與待測(cè)試樣同步處理。

        1.3.4 提取

        準(zhǔn)確稱取2i0.02g供試樣品于50mL離心管內(nèi),加入10%碳酸鈉水溶液5mL。加10mL乙酸乙酯提取,渦旋震蕩10min,8000r/min離心10min,重復(fù)提取一次,合并兩次上清液。向合并的上清液中加入0.1mol/L鹽酸溶液5mL,渦旋混勻,震蕩10min,5000r/min離心5min,重復(fù)提取一次,合并兩次水相,備用。

        1.3.5 凈化

        混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱依次用甲醇、一級(jí)水各3mL活化;取全部備用液過柱;再依次用一級(jí)水、甲醇各3 mL淋洗,減壓抽干;用5%氨水甲醇溶液3mL洗脫,洗脫液在50℃下用氮?dú)獯蹈?,殘余物用乙?0.1%甲酸溶液(5+95,V/V)1.0mL溶解,渦旋混勻,取上清液過濾,供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

        1.3.6 系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備

        準(zhǔn)確量取鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液,用乙腈-0.1%甲酸溶液(5+95,V/V)稀釋成濃度分別為5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、80ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

        取空白試樣2i0.02g于不同離心管中,按1.3.4、1.3.5步驟操作,制得濃度為0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、8.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL的對(duì)照溶液。

        1.4 儀器參數(shù)與測(cè)定

        1.4.1 色譜條件優(yōu)化

        色譜柱:WatersUPLCTMBEHC18(2.1NN 100mm,1.7μm);柱溫:40℃;流動(dòng)相:A-乙腈;B-0.1%甲酸溶液,梯度洗脫,進(jìn)樣量:10μL。

        1.4.2 質(zhì)譜條件

        離子源類型:ESI+;毛細(xì)管電壓:3.0KV;萃取補(bǔ)償電壓:70V;源溫:150℃;霧化溫度:450℃;錐孔氣流速:150L/hr;霧化氣流速:1000L/hr。

        1.5 精密度試驗(yàn)

        該研究選取多種空白樣品進(jìn)行添加回收率和精密度試驗(yàn),選取了3種基質(zhì)豬肉、牛肉、羊肉,按1.3.4和1.3.5步驟操作,添加水平分別為0.5μg/kg、1.0μg/kg、5.0μg/kg,按該文方法進(jìn)行前處理和測(cè)定,平行測(cè)定6次。

        1.6 方法應(yīng)用

        隨機(jī)抽檢動(dòng)物源性食品10份,采用該文建立的方法測(cè)定其中鹽酸克倫特羅的含量,并采用(原)農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-18-2008進(jìn)行復(fù)測(cè),進(jìn)行結(jié)果比對(duì)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 前處理優(yōu)化結(jié)果

        該研究采用3種前處理方法處理樣品,每種方法優(yōu)缺點(diǎn),見表1。

        表1 3種樣品前處理方法的比較

        2.2 色譜條件優(yōu)化結(jié)果

        試樣開始采用乙腈-水作為流動(dòng)相,發(fā)現(xiàn)響應(yīng)值較低,在水相中加入0.1%甲酸,可促進(jìn)其離子化,響應(yīng)值增高,于是采用0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相。

        2.3 標(biāo)曲溶液稀釋液的確定

        取陰性空白樣,按1.3.4、1.3.5步驟操作,配置一系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,同時(shí)用乙腈-0.1%甲酸溶液(5+95,V/V)配置相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,上機(jī)測(cè)定,用上述兩套標(biāo)曲處理同一個(gè)加標(biāo)濃度結(jié)果顯示,基質(zhì)標(biāo)曲溶液處理出來的結(jié)果是乙腈-0.1%甲酸溶液配置的標(biāo)曲處理的105%,說明經(jīng)前處理,凈化程度較高,基質(zhì)效應(yīng)影響較小。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,可直接采用乙腈-0.1%甲酸溶液配置標(biāo)曲溶液。

        2.4 線性關(guān)系、檢出限和定量限結(jié)果

        該研究采用乙腈-0.1%甲酸配置質(zhì)量濃度0.5~20 ng/mL的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液,按優(yōu)化后的液相質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定,線性關(guān)系良好,線性方程y=429.858x-53.1756(R2=0.999178),采用標(biāo)準(zhǔn)添加法,以信噪比S/N≥10確定定量限(LOQ)為0.5μg/kg,逐級(jí)稀釋,以信噪比S/N≥3確定方法檢出限0.25μg/kg,依據(jù)動(dòng)物源食品克倫特羅限量標(biāo)準(zhǔn)禁止檢出,所以定量限滿足要求。其線性回歸方程見圖1。

        圖1 鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系

        2.5 添加回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果

        三種基質(zhì)中,鹽酸克倫特羅的平均回收率80.2%~96.7%,相對(duì)偏差(RSD)為0.78~3.1,說明優(yōu)化的前處理方法所得結(jié)果的回收率和精密度滿足實(shí)驗(yàn)要求,符合定量分析,其回收率和精密度結(jié)果詳見表2。

        表2 鹽酸克倫特羅的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

        2.6 方法應(yīng)用結(jié)果

        對(duì)購(gòu)買的10份動(dòng)物源性食品,采用該文建立的方法與(原)農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-18-2008方法同時(shí)測(cè)定其中鹽酸克倫特羅的含量,均為陰性。

        3 結(jié)論與討論

        該研究建立了一種專門用于動(dòng)物源性食品中鹽酸克侖特羅含量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法,該研究與朱小艾等所建立的方法比較,液質(zhì)比液相定量更為準(zhǔn)確;與(原)農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-18-2008《動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》相比較,對(duì)樣品的前處理方法進(jìn)行優(yōu)化,不需要酶解過程,前處理時(shí)間由22h減少為1h,大大縮短前處理時(shí)間且提高了加標(biāo)回收率,回收率高達(dá)80.2%~96.7%。

        該研究采用乙腈-0.1%甲酸配置質(zhì)量濃度0.5~20 ng/mL的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液,按優(yōu)化后的液相質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定,線性關(guān)系良好,線性方程y=429.858x-53.1756(R2=0.999178),本研究還表明,鹽酸克倫特羅的平均回收率為80.2%~96.7%,相對(duì)偏差(RSD)為0.78~3.1,說明優(yōu)化的前處理方法所得結(jié)果的回收率和精密度滿足實(shí)驗(yàn)要求,符合定量分析。

        通過對(duì)市場(chǎng)上采購(gòu)的10份動(dòng)物源性食品羊肉、牛肉、豬肉樣品應(yīng)用該研究所建立的方法進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果與(原)農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-18-2008《動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》一致,表明所采購(gòu)的樣品均為陰性樣品,不含有鹽酸克倫特羅成分。

        各種結(jié)果表明,該研究所建立的方法具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的特點(diǎn),適用于樣品數(shù)量較大時(shí)的快速定量檢測(cè),為食品安全監(jiān)管部門提供了一個(gè)快速且準(zhǔn)確的定量檢測(cè)方法?!?/p>

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