李雪晶，牛玉秋，呂斯琦

腦卒中是導(dǎo)致人類殘疾死亡的常見病，腦卒中的首選治療方式為溶栓，但缺血區(qū)恢復(fù)血供常造成二次損傷，病人痊愈后仍伴有嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙[1]。其機(jī)制可能為腦缺血再灌注造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。神經(jīng)細(xì)胞損傷同時(shí)激活人體神經(jīng)元再生功能[2]。成年動(dòng)物腦中，前腦管膜下區(qū)(SVZ)和海馬齒狀回顆粒層下區(qū)(SGZ)是神經(jīng)再生的發(fā)生區(qū)。生理?xiàng)l件下，成年動(dòng)物齒狀回SGZ的新生神經(jīng)元遷移至齒狀顆粒層分化成熟，SVZ遷移至嗅球。病理情況下，新生神經(jīng)元除了正常遷移外，可向腦損傷部位發(fā)生遷移，并與損傷部位神經(jīng)元有效整合。因此，神經(jīng)元再生是恢復(fù)神經(jīng)功能障礙和學(xué)習(xí)認(rèn)知損傷的重要途徑[3]。有研究顯示，白芍總苷在改善神經(jīng)退行性疾病具有重要的藥理作用[4]。本研究采用中動(dòng)脈腦缺血再灌注(MCAO)模型探討白芍總苷改善大鼠缺血區(qū)神經(jīng)元再生的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與給藥 將40只無特定病原體(SPF)級(jí)雄性SD大鼠(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進(jìn)行中動(dòng)脈缺血再灌注造模，造模后隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、腦缺血再灌注組(MCAO組)、白芍總苷組(TGP200mg/kg)、白芍總苷+抑制劑組(TGP+PD173074 組，TGP 200 mg/kg+PD173074 2 mg/kg)，每組10只。連續(xù)灌胃14 d給予白芍總苷，腹腔注射抑制劑PD173074，Sham組與MCAO組給予等量生理鹽水，期間進(jìn)行行為學(xué)訓(xùn)練與測(cè)定。MCAO組與TGP組部分大鼠處死前3 d連續(xù)腹腔注射50 mg/kg的 5-溴-2-脫氧尿苷(BrdU)用于免疫熒光染色中標(biāo)記分裂細(xì)胞。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 圓頭尼龍線栓(廣州佳靈生物公司)；異氟烷(北京一品制藥公司)；2，3，5-三苯基四唑氯銨(TTC溶液，廣州鴻洲科技公司)；白芍總苷(西安開來生物科技公司)；PD173074(阿拉丁生物公司)；BrdU標(biāo)記物(美國Sigma公司)；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抗體、神經(jīng)元核抗原抗體(NeuN)、雙皮質(zhì)素(DCX)抗體、BrdU抗體(美國Abcam公司)；腦源神經(jīng)元營養(yǎng)因子(BDNF)抗體，細(xì)胞質(zhì)膜微囊蛋白-1(Caveolin-1)抗體，β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(武漢三鷹生物公司)；2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉(BCA)蛋白定量試劑盒、放射免疫沉淀(RIPA)裂解液(上海碧云天生物公司)。

1.3 腦缺血再灌注模型 參考文獻(xiàn)[5]造模方式，中動(dòng)脈腦缺血手術(shù)前使用0.5%～1.0%異氟烷(0.4 L/min)對(duì)大鼠進(jìn)行吸入式麻醉，完全麻醉后仰臥固定于泡沫板上，頸部切一個(gè)1.5 cm的傷口，在不損傷肌肉與神經(jīng)情況下分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈與頸外動(dòng)脈。止血夾固定頸總動(dòng)脈與頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈剪開一個(gè)微小傷口，自傷口插入一根圓頭尼龍線栓，緩慢前進(jìn)至頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)約1 cm。腦缺血2 h后，再次麻醉大鼠，取出線栓，恢復(fù)頸內(nèi)動(dòng)脈血液供給。手術(shù)期間，給予大鼠37 ℃保溫箱進(jìn)行保溫。術(shù)后持續(xù)給予分組藥物治療，并在術(shù)后第1天、第7天、第14天測(cè)定神經(jīng)功能。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)估 大腦受損后第1天、第7天、第14天應(yīng)用神經(jīng)學(xué)評(píng)分系統(tǒng)以Zea Longa標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行測(cè)評(píng)：0分為無神經(jīng)系統(tǒng)缺陷和正常肢體運(yùn)動(dòng)；1分為無法完全伸展右前肢；2分為向一側(cè)偏癱盤旋；3分為向一側(cè)跌倒偏癱；4分為無運(yùn)動(dòng)或自發(fā)行走和意識(shí)障礙；5分為死亡。

1.5 八臂迷宮測(cè)試 采用八臂迷宮設(shè)備評(píng)定空間學(xué)習(xí)記憶能力。設(shè)備中央為直徑22 cm的八角形競(jìng)技場(chǎng)，具有8個(gè)輻射臂，每條輻射臂長30 cm、寬10 cm，距地面100 cm。正式進(jìn)行八臂迷宮訓(xùn)練前，所有大鼠限制性喂食，以刺激在迷宮中覓食速度。訓(xùn)練過程中，將食物誘餌放置于手臂末端的容器中，間隔放置。將大鼠分別放置于迷宮中央，自由或誘導(dǎo)尋找食物，并記錄運(yùn)動(dòng)軌跡。術(shù)后治療1 d開始訓(xùn)練，每日訓(xùn)練2次，共5 d。測(cè)試期間，大鼠進(jìn)入手臂吃光所有食物或經(jīng)過5 min的最大時(shí)限，測(cè)試結(jié)束。工作記憶錯(cuò)誤：重新訪問前先用食物誘餌訪問過的手臂次數(shù)；參考記憶錯(cuò)誤：進(jìn)入食物誘餌的手臂。上述信息可評(píng)估大鼠長期記憶、學(xué)習(xí)能力。

1.6 動(dòng)物取材 最后一次神經(jīng)功能得分評(píng)估結(jié)束后，各組取6只大鼠采用水合氯醛深度麻醉后，使用生理鹽水進(jìn)行心臟灌流，迅速取出大腦組織，4 ℃條件下，3只置于生理鹽水中，3只置于4%多聚甲醛中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。剩余大鼠?jīng)水合氯醛深度麻醉后，迅速斷頭取腦，分離出海馬組織，-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 腦梗死體積評(píng)估 取出生理鹽水中的大腦組織，置于-20 ℃冰箱中冰凍10 min。對(duì)冰凍腦組織進(jìn)行切片處理，切成4片，快速置于2%TTC溶液中，暗環(huán)境條件下，37 ℃孵育30 min，使用4%多聚甲醛溶液固定10 min。使用Image Pro Plus 6.0圖像分析儀測(cè)量并計(jì)算腦梗死面積和腦體積(對(duì)側(cè)半球體積-同側(cè)非梗死體積/對(duì)側(cè)半球體積)。

1.8 免疫熒光雙染測(cè)定神經(jīng)元再生情況 取出多聚甲醛溶液中的腦組織，在蔗糖溶液中梯度脫水24 h。用冰凍切片機(jī)將腦組織切成20 μm組織片，收集組織片置于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中。對(duì)BrdU和DCX/NeuN進(jìn)行雙重免疫熒光染色。將組織切片使用PBS洗滌，浸入含10%驢血清和0.3%Triton X-100的PBS溶液中1 h，與抗DCX抗體、抗NeuN抗體在4 ℃孵育過夜。室溫下，將切片在二抗溶液中孵育1 h。BrdU免疫染色，將切片在2 mol/L HCl中于37 ℃孵育30 min以使DNA變性，并使用0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液(pH 8.4)中和10 min。PBS洗滌后，將切片與0.1%胰蛋白酶在37 ℃下孵育5 min，之后在含有10%驢血清和0.3%Triton X-100的PBS溶液中孵育10 min。將切片與大鼠抗BrdU抗體在4 ℃孵育過夜，之后使用PBS洗滌，并與驢抗大鼠抗體在室溫孵育1 h。將所有切片洗滌，使用帶有4′，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)防熒光猝滅試劑滴加在載玻片上，采用免疫熒光顯微鏡系統(tǒng)拍攝熒光照片，通過Image Pro Plus軟件分析平均熒光強(qiáng)度作為最終統(tǒng)計(jì)結(jié)果 。

1.9 免疫印跡法(Western Blotting)測(cè)定神經(jīng)元各蛋白表達(dá)情況 取出海馬組織，將RIPA裂解液按體積質(zhì)量比5 μL∶1 mg加入組織中并研磨勻漿10 min，4 ℃條件下再靜置裂解30 min。高速冰凍離心機(jī)4 ℃條件下12 000 r/min離心30 min。取上清液，以BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，以蛋白量10 μg進(jìn)行上樣，采用SDS-PAGE凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗抗體孵育、二抗抗體孵育。條帶洗凈后，均勻添加發(fā)光液，顯影儀顯影后使用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié) 果

2.1 白芍總苷對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死體積的影響 術(shù)后第7天及第14天，與MCAO組比較，TGP組神經(jīng)功能評(píng)分減小(P<0.05)。術(shù)后第14天，與TGP組比較，TGP+PD173074組神經(jīng)功能狀態(tài)無改善(P>0.05)。術(shù)后第14天，除Sham組，各組大鼠出現(xiàn)不同程度的腦梗死，其中MCAO組腦梗死嚴(yán)重。與MCAO組比較，TGP組梗死面積縮小(P<0.05)；與TGP組比較，TGP+PD173074組梗死面積增加(P<0.05)。提示本研究中腦缺血再灌注造模成功，MCAO組大鼠神經(jīng)功能損傷，出現(xiàn)大面積梗死，白芍總苷改善作用顯著，但VEGF抑制劑PD173074部分逆轉(zhuǎn)白芍總苷對(duì)神經(jīng)功能損傷和局部腦梗死的改善。詳見表1、圖1。

表1 白芍總苷對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響(±s) 單位：分

與MCAO組比較，＊P<0.05；與TGP組比較，△P<0.05。

2.2 白芍總苷對(duì)腦缺血后空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響 手術(shù)后14 d，與Sham組比較，MCAO組大鼠錯(cuò)誤次數(shù)增加(P<0.05)。TGP治療后，大鼠行為錯(cuò)誤次數(shù)降低，其中工作錯(cuò)誤次數(shù)降低。VEGF抑制劑干預(yù)增加大鼠錯(cuò)誤次數(shù)。詳見圖2。

與Sham組比較，#P<0.05；與MCAO組比較，＊P<0.05。

2.3 白芍總苷對(duì)MCAO大鼠Caveolin-1/VEGF信號(hào)通路和BDNF蛋白的影響 與Sham組比較，Caveolin-1和VEGF表達(dá)升高；與MCAO組比較，TGP+PD173074組Caceolin-1和VEGF表達(dá)升高(P<0.05)。PD173074除了抑制VEGF表達(dá)，減少了Caveolin-1和BDNF表達(dá)升高。詳見圖3。

a為Sham組；b為MCAO組；c為TGP組；d為TGP+PD173074組。與MCAO組比較，＊P<0.05；與TGP組比較，△P<0.05。

2.4 白芍總苷對(duì)MCAO大鼠BrdU+/DCX+免疫陽性細(xì)胞數(shù)量的影響 DCX是一種微管相關(guān)蛋白，可特異性地表達(dá)于由神經(jīng)干細(xì)胞分化而成的神經(jīng)前體細(xì)胞和處于遷移狀態(tài)的未成熟神經(jīng)元，是一個(gè)神經(jīng)再生標(biāo)記物[6]。與MCAO組比較，TGP組齒狀回區(qū)域含有較多的BrdU免疫陽性細(xì)胞和DCX免疫陽性細(xì)胞。免疫雙染(Merge)顯示，兩組BrdU+/DCX+免疫陽性細(xì)胞數(shù)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與MCAO組比較，TGP組大鼠海馬DCX總蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與TGP組比較，VEGF抑制劑PD173074顯著降低DCX總蛋白表達(dá)(P<0.05)。詳見圖4、圖5。

圖4 BrdU+/DCX+免疫雙染

與MCAO組比較，＊P<0.05；與TGP組比較，△P<0.05。

2.5 白芍總苷對(duì)MCAO大鼠BrdU+/NeuN+免疫陽性細(xì)胞數(shù)量的影響 與MCAO組比較，TGP組大鼠海馬BrdU+/NeuN+免疫陽性細(xì)胞數(shù)量增加。與MCAO組比較，TGP組大鼠海馬NeuN總蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與TGP組比較，VEGF抑制劑PD173074顯著降低了NeuN總蛋白表達(dá)(P<0.05)。提示TGP可增加缺血后海馬齒狀回區(qū)域海馬神經(jīng)元新生。詳見圖6、圖7。

圖6 BrdU+/NeuN+免疫雙染

a為Sham組；b為MCAO組；c為TGP組；d為TGP+PD173074組。與MCAO組比較，＊P<0.05；與TGP組比較，△P<0.05。

3 討 論

腦損傷和神經(jīng)變性機(jī)制與神經(jīng)血管單位中多種細(xì)胞相互作用有關(guān)，神經(jīng)細(xì)胞單位是由周細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和基底層組成。腦缺血/再灌注引起的神經(jīng)血管單位破壞導(dǎo)致血腦屏障損傷，神經(jīng)元死亡或變性，神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)和免疫細(xì)胞浸潤[7]。有研究顯示，白芍總苷在腦缺血再灌注損傷恢復(fù)過程中具有良好的藥理作用[8]。白芍總苷是否可促進(jìn)血管生成和神經(jīng)發(fā)生并補(bǔ)償缺血性腦損傷，關(guān)于促進(jìn)認(rèn)知、記憶功能恢復(fù)的研究較少。因此，本研究探討白芍總苷促進(jìn)血管生成和神經(jīng)發(fā)生的作用機(jī)制。

腦缺血再灌注成功造模大鼠出現(xiàn)腦部梗死，神經(jīng)功能評(píng)分降低，空間記憶能力損傷的癥狀。本研究結(jié)果顯示，白芍總苷可減少M(fèi)CAO大鼠梗死體積和神經(jīng)功能評(píng)分，恢復(fù)大鼠記憶功能。對(duì)于TGP+PD173074組大鼠，存在VEGF抑制劑的情況下，白芍總苷不能減少梗死體積、改善神經(jīng)功能和空間記憶能力。通過Western Blotting測(cè)量Caveolin-1、VEGF和BDNF表達(dá)水平。結(jié)果顯示，白芍總苷顯著上調(diào)Caveolin-1、VEGF和BDNF表達(dá)水平。PD173074在MCAO后第14天對(duì)這些蛋白質(zhì)表達(dá)有負(fù)面影響。提示Caveolin-1/VEGF途徑可能是缺血性損傷后白芍總苷介導(dǎo)過程中的信號(hào)途徑之一。

有研究顯示，丹參酮ⅡA部分通過MARK42/44介導(dǎo)BDNF和神經(jīng)生長因子(NGF)信號(hào)增強(qiáng)神經(jīng)元分化，活化的Caveolin-1具有促進(jìn)丹參酮ⅡA跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)觸發(fā)神經(jīng)元分化的作用，且Caveolin-1敲除導(dǎo)致神經(jīng)元分化停止[9]。另有研究顯示，BDNF有利于腦缺血后神經(jīng)元蛋白特異性上調(diào)，突觸發(fā)育和神經(jīng)認(rèn)知功能改善[10]。通過腺病毒轉(zhuǎn)染VEGF蛋白移植到缺血大鼠腦梗死區(qū)，檢測(cè)到VEGF和BDNF表達(dá)持續(xù)增加，從而改善大腦微血管密度和神經(jīng)元凋亡[11]。BDNF通過激活多數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞的激活受體，對(duì)調(diào)節(jié)血管發(fā)育、應(yīng)對(duì)損傷的反應(yīng)均具有重要的作用。有研究顯示，BDNF誘導(dǎo)的磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(TrkB)活化可能介導(dǎo)內(nèi)皮存活，從而促進(jìn)血管生成[12]。本研究中MCAO大鼠中使用白芍總苷和VEGF抑制劑的情況下，TGP組海馬BDNF表達(dá)升高，而TGP+PD173074組BDNF表達(dá)降低，并造成腦梗死和神經(jīng)功能恢復(fù)受損。提示Caveolin-1和VEGF均與BDNF有關(guān)，且白芍總苷通過Caveolin-1/VEGF信號(hào)通路增強(qiáng)腦缺血后血管新生過程，而BDNF是協(xié)同血管修復(fù)中重要的因素之一。

相關(guān)研究顯示，腦出血、腦梗死等缺血性疾病早期對(duì)海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生具有抑制作用，隨著腦血管痙攣逐漸緩解，3 d后神經(jīng)再生區(qū)功能逐漸恢復(fù)并表現(xiàn)為代償性功能上調(diào)[13]。神經(jīng)再生中海馬區(qū)神經(jīng)再生發(fā)生于SGZ，是神經(jīng)再生重要的組成部分。中動(dòng)脈閉塞后誘導(dǎo)腦血管痙攣，造成腦組織缺血，各種缺血因子表達(dá)上調(diào)，作用于SGZ神經(jīng)元再生，增強(qiáng)該區(qū)神經(jīng)元功能再生功能，SGZ新生神經(jīng)元遷移至顆粒細(xì)胞層并分化為成熟神經(jīng)元[14]。BrdU作為一種胸腺嘧啶核苷類似物，在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶作為原料參與DNA復(fù)制過程，測(cè)定DNA復(fù)制活性并準(zhǔn)確地反映細(xì)胞增殖情況[15]。本研究結(jié)果顯示，白芍總苷治療14 d后，與Sham組比較，大腦BrdU+/DCX+和BrdU+/NeuN+雙標(biāo)記細(xì)胞增加，且DCX與NeuN總蛋白水平均升高，而VEGF抑制劑引起兩種蛋白表達(dá)降低，提示白芍總苷增強(qiáng)海馬齒狀回區(qū)神經(jīng)再生，而VEGF抑制劑部分逆轉(zhuǎn)了白芍總苷促進(jìn)神經(jīng)再生的功能。

綜上所述，白芍總苷通過Caveolin-1/VEGF信號(hào)通路改善大腦海馬BDNF水平，促進(jìn)海馬齒狀回SGZ神經(jīng)元再生，緩解缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能損傷，減少缺血側(cè)腦梗死，改善學(xué)習(xí)記憶功能。