林 海，何坤達(dá)，王顯著，田 兵，宿長軍

抑郁癥所致疲乏屬中醫(yī)學(xué)“郁病”“虛勞”范疇。抑郁癥是一種以持續(xù)性心境低落為主要特征的情緒障礙綜合征，具有慢性、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)。疲乏是抑郁癥的核心癥狀之一[1]，主要臨床表現(xiàn)為缺乏動(dòng)力和能量、感覺身體活動(dòng)緩慢等，疲乏相關(guān)癥狀嚴(yán)重影響病人生活及工作能力。疲乏也是抑郁癥的殘留癥狀之一[1]，相關(guān)研究顯示，經(jīng)過14周的選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSR1)治療后，約60.8%的病人存在疲乏的殘留癥狀[2]。本研究觀察解郁養(yǎng)肝湯對(duì)應(yīng)激性抑郁大鼠海馬及血清炎性因子白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素6(IL-6)表達(dá)水平的影響，探討抑郁癥疲乏的可能機(jī)制及解郁養(yǎng)肝湯抗抑郁、解除疲乏癥狀的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SpragueDawley(SD)成年雌性大鼠140只，體重180～220 g，購自西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，陜西中醫(yī)藥中心實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。本研究獲得陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 解郁養(yǎng)肝湯由西安市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科制成浸膏，每克浸膏相當(dāng)于含原生藥5 g，4 ℃保存。鹽酸氟西汀(禮來蘇州制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：每粒20 mg，批準(zhǔn)文號(hào)：9701B，由西安市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科提供)研缽粉碎，溶于適量蒸餾水制成懸液，4 ℃保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備產(chǎn)品)；電子精密天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：FA1004N)；水平離心機(jī)(LD-42型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn))；DK-8A型電恒溫水浴箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；A0-800病理切片機(jī)(上海醫(yī)療器械廠生產(chǎn))；OLYMPUS全自動(dòng)顯微鏡照相裝置(PM-10AD型，日產(chǎn))；冰箱(西門子公司)等。

1.4 模型制備 實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行1%的蔗糖水訓(xùn)練3 d，改變大鼠之前的飲水習(xí)慣。第4天禁水24 h后，行糖水偏好實(shí)驗(yàn)12 h，計(jì)算12 h內(nèi)大鼠糖水飲用量，根據(jù)測(cè)量結(jié)果和體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、氟西汀組、解郁顆粒組、解郁養(yǎng)肝湯高劑量組、解郁養(yǎng)肝湯中劑量組和解郁養(yǎng)肝湯低劑量組，每組20只。除空白對(duì)照組，其余各組通過慢性不可預(yù)知應(yīng)激刺激與孤養(yǎng)相結(jié)合方法制造抑郁模型。所有大鼠獨(dú)籠飼養(yǎng)，在21 d內(nèi)隨機(jī)每日給予一種刺激，同一種刺激不能連續(xù)出現(xiàn)，使動(dòng)物不能預(yù)知給予的應(yīng)激。

1.5 大鼠行為學(xué)觀察 于實(shí)驗(yàn)第22天、第43天分別測(cè)定各組大鼠跑臺(tái)有氧力竭運(yùn)動(dòng)、懸尾實(shí)驗(yàn)和爬桿時(shí)間。跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)：根據(jù)Bed-ford大鼠體重?cái)z氧量建立回歸方程漸增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)模型，行為特征為呼吸急深及幅度大、腹臥位、垂頭、刺激后無反應(yīng)。懸尾實(shí)驗(yàn)：將各組大鼠尾端1 cm部位粘貼于一水平木板上，木板離地10 cm以上，大鼠呈倒掛狀；懸尾兩側(cè)用板隔開大鼠視線為克服不正常體位而掙扎活動(dòng)，活動(dòng)一段時(shí)間后，出現(xiàn)間隔性“不動(dòng)”顯示“疲勞、失望”狀態(tài)，計(jì)算6～8 min內(nèi)“不動(dòng)時(shí)間”，并同時(shí)觀察大鼠掙扎幅度及抑郁狀態(tài)。爬桿實(shí)驗(yàn)：將各組大鼠放于長25 cm，直徑1 cm的光滑有機(jī)玻璃棒上，使其肌肉處于緊張狀態(tài)，第3次落水時(shí)終止實(shí)驗(yàn)，累計(jì)3次大鼠從玻璃棒跌落時(shí)間。

1.6 各組大鼠海馬及血清炎性因子IL-1β、IL-6表達(dá)測(cè)定 第43天時(shí)大鼠經(jīng)常規(guī)麻醉，心臟灌洗，斷頭取腦，多聚甲醛固定，之后剝離腦組織取海馬組織，置于4%的多聚甲醛溶液固定48 h以上，經(jīng)常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明、浸蠟、包埋固定制成蠟塊，連續(xù)冠狀切片，厚度為5μm，免疫組化法檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元IL-1β、IL-6陽性細(xì)胞數(shù)量。將大鼠經(jīng)常規(guī)麻醉，心臟灌洗后，從大鼠股動(dòng)脈取血3mL，混勻，室溫放置15min，3 500 r/min離心10 min，分離血清，置于4 ℃冰箱保存，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清IL-1β、IL-6含量。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)完成情況 實(shí)驗(yàn)過程中，模型組、氟西汀組、解郁顆粒組、解郁養(yǎng)肝湯高劑量組、解郁養(yǎng)肝湯中劑量組和解郁養(yǎng)肝湯低劑量組各死亡2只，空白對(duì)照組死亡1只，解剖無特殊發(fā)現(xiàn)，死亡原因不明。最后納入統(tǒng)計(jì)分析的大鼠共127只，空白對(duì)照組19只，模型組、氟西汀組、解郁顆粒組、解郁養(yǎng)肝湯高劑量組、解郁養(yǎng)肝湯中劑量組和解郁養(yǎng)肝湯低劑量組各18只。

2.2 各組大鼠跑臺(tái)有氧力竭運(yùn)動(dòng)比較 實(shí)驗(yàn)第22天，各造模組大鼠通過第一級(jí)、第二級(jí)負(fù)荷及第三級(jí)負(fù)荷力竭前總時(shí)長較空白對(duì)照組縮短(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)第43天，氟西汀組、解郁顆粒組、解郁養(yǎng)肝湯高劑量組、解郁養(yǎng)肝湯中劑量組和解郁養(yǎng)肝湯低劑量組大鼠通過第一級(jí)、第二級(jí)負(fù)荷及第三級(jí)負(fù)荷力竭前總時(shí)長較模型組延長(P<0.05或P<0.01)；解郁養(yǎng)肝湯高劑量組和解郁養(yǎng)肝湯中劑量組大鼠通過第一級(jí)、第二級(jí)負(fù)荷及第三級(jí)負(fù)荷力竭前總時(shí)長較氟西汀組延長(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠跑臺(tái)有氧力竭運(yùn)動(dòng)比較(±s) 單位：s

2.3 各組大鼠懸尾實(shí)驗(yàn)中靜止時(shí)間比較 實(shí)驗(yàn)第22天，各造模組大鼠懸尾實(shí)驗(yàn)中靜止時(shí)間總時(shí)長較空白對(duì)照組延長(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)第43天，氟西汀組、解郁顆粒組、解郁養(yǎng)肝湯高劑量組、解郁養(yǎng)肝湯中劑量組和解郁養(yǎng)肝湯低劑量組大鼠懸尾實(shí)驗(yàn)中靜止時(shí)間總時(shí)長較模型組縮短(P<0.05或P<0.01)；解郁養(yǎng)肝湯高劑量組和解郁養(yǎng)肝湯中劑量組大鼠懸尾實(shí)驗(yàn)中靜止時(shí)間總時(shí)長較氟西汀組縮短(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠懸尾實(shí)驗(yàn)中靜止時(shí)間比較(±s) 單位：s

2.4 各組大鼠爬桿時(shí)間比較 實(shí)驗(yàn)第22天，各造模組大鼠爬桿總時(shí)長較空白對(duì)照組縮短(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)第43天，氟西汀組、解郁顆粒組、解郁養(yǎng)肝湯高劑量組、解郁養(yǎng)肝湯中劑量組和解郁養(yǎng)肝湯低劑量組大鼠爬桿總時(shí)長較模型組延長(P<0.05或P<0.01)；解郁養(yǎng)肝湯高劑量組和解郁養(yǎng)肝湯中劑量組大鼠爬桿總時(shí)長較氟西汀組延長(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠爬桿時(shí)間比較(±s) 單位：s

2.5 各組大鼠海馬神經(jīng)元IL-1β、IL-6陽性細(xì)胞數(shù)量比較 實(shí)驗(yàn)第43天，各組大鼠海馬CA區(qū)均有IL-1β、IL-6表達(dá)。氟西汀組、解郁顆粒組、解郁養(yǎng)肝湯高劑量組、解郁養(yǎng)肝湯中劑量組和解郁養(yǎng)肝湯低劑量組大鼠海馬神經(jīng)元IL-1β、IL-6陽性細(xì)胞數(shù)量較模型組減少(P<0.05)；解郁養(yǎng)肝湯高劑量組、解郁養(yǎng)肝湯中劑量組和解郁養(yǎng)肝湯低劑量組與氟西汀組、解郁顆粒組大鼠海馬比較，IL-1β和IL-6陽性細(xì)胞數(shù)量下降(P<0.05或P<0.01)。詳見表4、圖1及圖2。

表4 各組大鼠海馬神經(jīng)元IL-1β、IL-6陽性細(xì)胞數(shù)量比較(±s)

圖1 各組大鼠海馬神經(jīng)元IL-1β陽性細(xì)胞數(shù)量比較(免疫組化，×200)

圖2 各組大鼠海馬神經(jīng)元IL-6陽性細(xì)胞數(shù)量比較(免疫組化，×300)

2.6 各組大鼠血清IL-1β、IL-6含量比較 實(shí)驗(yàn)第43天，各組大鼠血清均有IL-1β、IL-6表達(dá)。氟西汀組、解郁顆粒組、解郁養(yǎng)肝湯高劑量組、解郁養(yǎng)肝湯中劑量組和解郁養(yǎng)肝湯低劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6含量較模型組降低(P<0.05)；解郁養(yǎng)肝湯高劑量組、解郁養(yǎng)肝湯中劑量組和解郁養(yǎng)肝湯低劑量組與氟西汀組、解郁顆粒組比較，血清IL-1β和IL-6含量下降(P<0.05或P<0.01)。詳見表5。

表5 各組大鼠血清IL-1β、IL-6含量比較(±s)

3 討 論

慢性輕度不可預(yù)見性的應(yīng)激抑郁模型(CUMS)是抑郁癥常用的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀１狙芯吭诖四Ｐ突A(chǔ)上改進(jìn)，采用慢性輕度不可預(yù)知應(yīng)激抑郁模型加孤養(yǎng)，使得抑郁模型更穩(wěn)定和科學(xué)。造模21 d內(nèi)隨機(jī)選取多種不同的應(yīng)激因素刺激大鼠，使得大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生，造成孤養(yǎng)動(dòng)物抑郁狀態(tài)。本研究在有限條件下，采用大鼠模型模擬人類抑郁癥的臨床表現(xiàn)和病理變化[3]，對(duì)研究抑郁癥發(fā)病機(jī)制和藥物治療具有重要的指導(dǎo)意義。解郁養(yǎng)肝湯高劑量組、解郁養(yǎng)肝湯中劑量組和解郁養(yǎng)肝湯低劑量組大鼠通過第一級(jí)、第二級(jí)負(fù)荷及第三級(jí)負(fù)荷力竭前用總時(shí)長較模型組延長(P<0.05或P<0.01)，爬桿總時(shí)長較模型組延長(P<0.01)，懸尾實(shí)驗(yàn)中靜止時(shí)間總時(shí)長較氟西汀組、解郁顆粒組減小(P<0.01)。表明解郁養(yǎng)肝湯可改善抑郁模型實(shí)驗(yàn)大鼠抑郁狀態(tài)和疲乏癥狀。

抑郁癥病人存在免疫系統(tǒng)異常，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用外，同時(shí)介導(dǎo)了一系列類似抑郁的行為和情感障礙。其中炎性因子IL-1β和IL-6生成增多與抑郁癥關(guān)系密切，IL-1β和IL-6是抑郁癥的特異性指標(biāo)[4]。有研究顯示，抑郁癥病人體內(nèi)常存在較高水平的炎性因子，炎性因子導(dǎo)致多種神經(jīng)精神癥狀，其中包括抑郁癥發(fā)作[5]。有研究顯示，慢性不可預(yù)見應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)抑郁樣行為同時(shí)大鼠海馬和血漿IL-1β、IL-6水平明顯升高[6]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)在疲勞感知中發(fā)揮著重要作用，中樞神經(jīng)系統(tǒng)處理和重視感官信息，引導(dǎo)動(dòng)機(jī)行為包括決定停止活動(dòng)或投入努力。慢性疲勞綜合征病人普遍存在白質(zhì)損傷及腦萎縮(海馬、紋狀體、丘腦、頂葉和額葉等)[7]，提示這些區(qū)域損傷可能是疲乏產(chǎn)生的關(guān)鍵，上述部位已證實(shí)是細(xì)胞因子作用的靶點(diǎn)[8]。細(xì)胞因子認(rèn)為是誘導(dǎo)中樞疲勞的重要介質(zhì)，其中IL-1β、IL-6多數(shù)殘留在內(nèi)部細(xì)胞，在外周血液循環(huán)與其他細(xì)胞結(jié)合蛋白質(zhì)，如2型IL-1受體(IL-1R2)、IL-6受體，其充當(dāng)誘餌受體，導(dǎo)致生物活性降低[9]。外周產(chǎn)生的IL-1β、IL-6通過多條途徑到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，一旦到達(dá)中樞，其在中樞濃度增加影響神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)(如多巴胺和5-羥色胺)，從而對(duì)抑郁和疲勞的發(fā)展產(chǎn)生影響[10-11]。

目前，抑郁癥及抑郁癥病人出現(xiàn)疲乏發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，存在許多假說。本研究結(jié)果顯示，解郁養(yǎng)肝湯高劑量組、解郁養(yǎng)肝湯中劑量組和解郁養(yǎng)肝湯低劑量組與氟西汀組、解郁顆粒組比較，血清IL-1β、IL-6含量明顯降低(P<0.05或P<0.01)。推測(cè)本研究使用的解郁養(yǎng)肝湯緩解大鼠疲乏機(jī)制可能通過下調(diào)機(jī)體炎性因子IL-1β、IL-6表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。解郁養(yǎng)肝湯可能在改善抑郁同時(shí)對(duì)解除疲乏發(fā)揮促進(jìn)作用。