馬立聰，田旭陽*，王興宇，高 芳，董文杰，武金寶，黨 彤，賈彥彬,,5

胃癌是一種復(fù)雜的多因素、多階段疾病，幽門螺桿菌(

Helicobacter

pylori

,Hp)是胃癌的重要致病因素之一，資料顯示74.7%～89.0%的胃癌患者曾感染過Hp，世界范圍內(nèi)約有50%的人群曾感染過Hp，但最終僅有1%～3%罹患胃癌，提示個(gè)體的遺傳因素在胃癌變過程中扮演了重要的角色。Hippo信號(hào)通路是哺乳動(dòng)物中的一條腫瘤抑制通路，參與細(xì)胞的增殖、分化和死亡，調(diào)節(jié)組織器官大小。Yes相關(guān)蛋白(Yes associated protein,YAP)是Hippo信號(hào)通路中的效應(yīng)因子，與正常胃黏膜比較，胃癌組織的YAP表達(dá)水平明顯上調(diào)，并且與胃癌預(yù)后差相關(guān)，因此，

YAP

是研究胃癌變的重要候選基因之一。研究報(bào)道

YAP

基因SNP rs11225163可能與皮膚黑色素瘤以及肝細(xì)胞癌的發(fā)病關(guān)聯(lián)，SNP rs1820453與女性乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)以及小細(xì)胞癌患者的生存率相關(guān)，但是有關(guān)

YAP

基因多態(tài)性與Hp感染以及非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性研究未見報(bào)道。該研究檢測了SNP rs11225163和rs1820453與Hp感染以及非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，旨在為胃癌以及Hp感染相關(guān)疾病的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 病例資料

研究對(duì)象在課題組已發(fā)表文獻(xiàn)中詳細(xì)描述，即病例組381例，為2008—2017年在包頭市腫瘤醫(yī)院經(jīng)病理學(xué)確診為非賁門胃癌的患者，所有患者均為漢族，且三代無與其他民族通婚史，發(fā)病時(shí)已在包頭市居住5年以上的原發(fā)病例,并且未接受過化療和放療。對(duì)照組共427例，為同期包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院和內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院的正常體檢人群，所有對(duì)照均為漢族，且三代無與其他民族通婚史，已在包頭市居住5年以上，并且未接受過Hp根除治療，無胃部疾病史和其他遺傳病。所有參加本研究的患者和對(duì)照者留取2 ml外周血，并提供知情同意書，本研究已獲包頭醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1

SNP的篩選 根據(jù)HapMap數(shù)據(jù)庫(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的中國漢族人群多態(tài)性數(shù)據(jù)，在

YAP

基因進(jìn)行了標(biāo)記單核苷酸多態(tài)性(Tag-SNP)的篩選，要求最小等位基因頻率(MAF)>0.05，連鎖不平衡相關(guān)系數(shù)(r)>0.8。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的可能與疾病相關(guān)的SNP，優(yōu)先選擇了rs11225163和rs1820453兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分析。

1.2.2

基因分型 采用外周血DNA提取試劑盒提取808例樣本外周血白細(xì)胞DNA，試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。采用Taqman探針法對(duì)808例樣本進(jìn)行基因分型，基因分型在北京賽默百合生物科技有限公司完成。實(shí)驗(yàn)中設(shè)陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，基因分型沒有成功的樣本不再進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中隨機(jī)選取5%DNA質(zhì)量和數(shù)量較好的樣本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性。經(jīng)檢測，所有重復(fù)樣本基因分型結(jié)果的一致性為100%。

1.2.3

正常對(duì)照中Hp感染的檢測 采用血清學(xué)方法檢測Hp的感染情況。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法確定正常對(duì)照外周血血清中抗Hp抗體的滴度。試劑盒購自蘇州艾萊薩生物科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作和結(jié)果判定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用R軟件(version3.5.0; http://www.r-project.org)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，年齡采用

t

檢驗(yàn)比較病例組和對(duì)照組間的差異，性別采用χ檢驗(yàn)比較組間分布差異。使用R軟件的“genetics”包的Pearson χ檢驗(yàn)，檢驗(yàn)各基因多態(tài)位點(diǎn)的基因型分布在對(duì)照組人群中是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。采用非條件性Logistic回歸法計(jì)算經(jīng)年齡、性別調(diào)整后的

OR

值以及95%

CI

，用以評(píng)估兩個(gè)SNP在共顯性、顯性、超顯性、隱性和附加等5種遺傳模式下與Hp感染以及非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性，采用Haploview 4.2軟件構(gòu)建單體型，分析單體型與Hp感染以及非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)。

2 結(jié)果

2.1 808例樣本一般情況比較

本實(shí)驗(yàn)共納入研究樣本808例，其中非賁門胃癌患者(病例組)381例，正常人群(對(duì)照組)427例。病例組中男性286例(75.1%)，女性95例(24.9%)，年齡中位數(shù)為60歲，四分位間距為52～69歲；對(duì)照組中男性320例(74.9%)，女性107例(25.1%)，年齡中位數(shù)為57歲，四分位間距為50～65歲。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，病例組與對(duì)照組的年齡分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=-4.437，

P

<0.001)，性別分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ=0.002，

P

>0.05)。

2.2 對(duì)照組Hp感染陽性和陰性的一般情況比較

對(duì)照組中，Hp感染呈陰性和陽性者分別為225例和202例,陽性率為47.3%。在Hp感染陰性組中，男性和女性分別為169例(75.1%)和56例(24.9%)，年齡中位數(shù)為54歲，四分位間距為50～66歲；在Hp感染陽性組中，男性和女性分別為151例(74.8%)和51例(25.2%)，年齡中位數(shù)為53歲，四分位間距為49～64歲。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，Hp感染陰性組與Hp感染陽性組的年齡分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=0.863，

P

>0.05)，性別分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ=0.007，

P

>0.05)。

2.3 對(duì)照組

基因SNP rs11225163和rs1820453與Hp感染的關(guān)聯(lián)性

在正常對(duì)照中，SNP rs11225163和rs1820453的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，提示所選樣本具有人群代表性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，

YAP

基因SNP rs11225163和rs1820453在共顯性、顯性、超顯性、隱性和附加等5種遺傳模式下與Hp感染均無關(guān)聯(lián)，見表1。

表1 5種遺傳模型下SNP rs11225163、rs1820453與Hp感染的關(guān)聯(lián)性

2.4

基因SNP rs11225163和rs1820453與非賁門胃癌的關(guān)聯(lián)性

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，

YAP

基因SNP rs11225163和rs1820453在共顯性、顯性、超顯性、隱性和附加等5種遺傳模型下與非賁門胃癌均無關(guān)聯(lián)，見表2。

表2 5種遺傳模型下SNP rs11225163、rs1820453與非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性

2.5

基因的單體型與Hp感染及非賁門胃癌發(fā)生的關(guān)系

使用Haploview 4.2軟件對(duì)

YAP

基因2個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析，計(jì)算LOD值、連鎖不平衡系數(shù)D′，采用D′置信區(qū)間法構(gòu)建單體型。結(jié)果顯示，以Hp感染或非賁門胃癌為結(jié)局變量，所研究的

YAP

基因2個(gè)SNP位點(diǎn)之間均未構(gòu)成單體型塊。

3 討論

目前，攻克胃癌仍是世界性難題，其發(fā)病率和死亡率均位居所有惡性腫瘤前列，雖然隨著醫(yī)療水平的提升，其致死率有所下降，但每年在世界范圍內(nèi)仍有100萬左右的新發(fā)病例，嚴(yán)重影響著人類的健康。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療對(duì)于胃癌患者至關(guān)重要，尋找切實(shí)有效的生物標(biāo)志物以及精準(zhǔn)的靶向治療一直是人們努力的方向。Hp是目前公認(rèn)的引起胃癌的危險(xiǎn)因子，并于1994年被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)定義為胃的Ⅰ類致癌原，環(huán)境和宿主等多因素作用會(huì)導(dǎo)致Hp的感染。首先Hp感染并定植于胃黏膜，導(dǎo)致一種慢性持久性炎癥-慢性萎縮性胃炎，如果不進(jìn)行干預(yù)和治療，這種慢性炎癥將會(huì)持續(xù)數(shù)年至數(shù)十年，持續(xù)的慢性萎縮性胃炎經(jīng)過腸上皮化生-低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變-高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變，最終會(huì)導(dǎo)致<3%的Hp感染者罹患胃癌。胃癌分為賁門癌和非賁門癌兩類，賁門癌在流行病學(xué)、臨床病理特征及分子生物學(xué)特征等方面與食管癌相近，為了保持研究樣本的均質(zhì)性，本研究中我們將病例限定為非賁門胃癌。

Hippo信號(hào)通路是一條腫瘤抑制通路，它在哺乳動(dòng)物中高度保守，由13個(gè)核心組件構(gòu)成，其中YAP是通路中的效應(yīng)因子，受上游活化的LATS蛋白的磷酸化作用使其激活，作為轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子與轉(zhuǎn)錄因子TEAD結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化以及死亡，調(diào)節(jié)組織器官大小。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，位于YAP上游的LATS蛋白在非賁門胃癌組織中的表達(dá)水平顯著低于正常胃組織，并且

LATS

基因SNP與Hp感染及非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)。因此，本研究繼續(xù)檢測了

YAP

基因多態(tài)性與Hp感染及非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性。Yuan et al在美國德克薩斯州人群中的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，

YAP

基因SNP rs11225163與皮膚黑色素瘤的發(fā)病相關(guān)，攜帶CC基因型與較短的生存期相關(guān)。此外，El-Derany et al的研究表明，在埃及男性患者中，

YAP

基因SNP rs11225163與肝細(xì)胞癌的發(fā)病相關(guān)，C等位基因在非酒精性脂肪肝患者中與肝細(xì)胞癌的發(fā)病呈負(fù)相關(guān)。Chen et al在研究中發(fā)現(xiàn)

YAP

基因SNP rs1820453與中國女性乳腺癌的發(fā)病相關(guān)，攜帶CC基因型者患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。Wu et al發(fā)現(xiàn)，攜帶

YAP

rs1820453 TG或GG基因型的小細(xì)胞肺癌患者生存率下降，G等位基因是影響小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的因素之一。目前國內(nèi)外尚無有關(guān)

YAP

基因多態(tài)性與Hp感染及胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系的報(bào)道。本研究中，我們通過病例對(duì)照關(guān)聯(lián)研究的方法在808例樣本中研究了

YAP

基因SNP rs11225163和rs1820453與Hp感染及非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，并未發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)SNP與Hp感染以及非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)聯(lián)，與上述文獻(xiàn)報(bào)道不符，首先這可能是由于同一多態(tài)性在不同的疾病中起到的作用不同導(dǎo)致；其次也可能與各項(xiàng)研究的對(duì)象的種族和人群亞結(jié)構(gòu)的差異相關(guān)；第三，本研究樣本量偏少，僅納入808例樣本，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果還需進(jìn)一步研究證實(shí)。