李呈呈，吳其超，馬 燕，栗雨昊，臧德奎

（1. 山東農(nóng)業(yè)大學 林學院 黃河下游國家林業(yè)和草原局林業(yè)重點實驗室，山東 泰安 271018；2. 泰山學院 數(shù)學與統(tǒng)計學院，山東 泰安 271000）

彩葉桂品種群Osmanthus fragrans Colour Group是近年來新培育的桂花新類型，其營養(yǎng)體部分(即枝條和葉片)有著完全不同于綠色的明顯色彩變異，并能夠維持較長時間[1]。彩葉桂觀賞期更長，園林用途更廣泛，未來前景十分廣闊。然而，由于低溫的限制，目前彩葉桂的栽培主要局限于長江流域及以南地區(qū)，尚未得到有效的開發(fā)應用[2]。另外，迄今尚未有關于彩葉桂抗寒相關的系統(tǒng)研究，其抗寒品種的篩選和適宜種植的范圍尚不明確，這也極大地限制了彩葉桂的推廣和應用。低溫是影響自然界植物正常生長和分布的一項關鍵因素[3]，因此，研究低溫對植物的影響具有重要的價值。低溫環(huán)境中，植物細胞膜、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化酶等都會產(chǎn)生一系列變化以抵御低溫傷害。因此，通常采用相對電導率、丙二醛、可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、超氧化物歧化酶、過氧化物酶等生理指標作為評價植物抗寒性的參考依據(jù)[4?5]。本研究以6個不同彩葉桂品種為試驗材料，通過測定其相對電導率、丙二醛質(zhì)量摩爾濃度、可溶性糖質(zhì)量分數(shù)、可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)、超氧化物歧化酶活性、過氧化物酶活性等6項生理指標的變化，探討6種彩葉桂對低溫脅迫的響應，完成部分彩葉桂的抗寒性評價。據(jù)此篩選適應北方地區(qū)露地栽培的優(yōu)良彩葉桂品種，對彩葉桂的推廣和應用具有一定的參考意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

材料均取自山東農(nóng)業(yè)大學林學試驗站。6個彩葉桂品種為‘傲霜’‘Aoshuang’、‘冬榮’‘Dongrong’、‘羅彩1號’‘Luocai No.1’、‘羅彩2號’‘Luocai No.2’、‘永?；貌省甕ongfu Huancai’、‘銀碧雙輝’‘Yinbi Shuanghui’。2019年11月中旬，選擇各品種長勢良好一致、無病蟲害的4年生扦插苗，剪取1年生枝上第3～5節(jié)位大小均勻的葉片，用塑封袋裝好置于冰盒帶回實驗室。

1.2 低溫處理

將采回的葉片混勻，每個品種分成均勻的9份，設3次重復，洗凈并吸干水分，將1組放置在25 ℃室溫中進行對照處理，另外8組放置在可控溫冰箱中，按照預設的8個溫度梯度(即0、?4、?8、?12、?16、?20、?24、?28 ℃)給予人工低溫處理。以隔10 min下降1 ℃的速度降溫，降到目的溫度后放置24 h，取出1組葉片在4 ℃冰箱中解凍8 h后測定。其余葉片繼續(xù)按設定梯度處理。

1.3 生理指標測定

相對電導率的測定采用電導法[6]，將各處理溫度下的相對電導率和各處理溫度的關系用Logistic方程進行擬合[7]，當擬合度顯著時計算拐點溫度即半致死溫度(TL50)，可溶性糖質(zhì)量分數(shù)的測定采用蒽酮法，可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)采用考馬斯亮藍比色法[8]，丙二醛質(zhì)量摩爾濃度采用硫代巴比妥酸法，超氧化物歧化酶活性采用NBT法，過氧化物酶活性采用愈創(chuàng)木酚法[9]。

1.4 數(shù)據(jù)分析和綜合評價

應用 Excel 2016、SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，利用單因素方差分析 (one-way ANOVA)和Duncan新復極差法(Duncan’s multiple-range)進行差異顯著性分析，圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；不同小寫字母表示各品種內(nèi)不同低溫間在 P＜0.05水平上具有顯著性差異。

通過隸屬函數(shù)法對6個彩葉桂品種的抗寒性進行綜合性評價。隸屬函數(shù)值計算公式：

式(1)～(2)中：U(xij)為i品種j指標的隸屬函數(shù)值；xij為測定值；xjmax和xjmin分別為j指標測定的最大值和最小值。式(1)用于計算指標與抗寒性呈正相關的情況，式(2)用于計算呈負相關的情況[10]。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對 6個彩葉桂品種葉片相對電導率的影響

從圖1可見：不同低溫脅迫下6個彩葉桂品種相對電導率的變化趨勢較為相似，都隨溫度的下降逐漸升高。在輕度低溫脅迫時(0～?4 ℃)，相對電導率升高較為緩慢，處于較低水平；隨著溫度的進一步下降(?4～?20 ℃)，電導率表現(xiàn)快速增加的趨勢。品種不同增幅不同?！栏；貌省茸钚。菍φ盏?.16倍，‘傲霜’增加幅度最大，是對照的8.42倍，且各品種的相對電導率都已大于60%，說明此時已經(jīng)出現(xiàn)了嚴重的離子滲透；降溫后期(?20～?28 ℃)，各品種相對電導率增加幅度很小，可見脅迫后期植物葉片細胞膜已受到相當嚴重破壞，幾乎全部的離子都已滲透到細胞外，植株接近死亡。

圖1 低溫脅迫下各品種葉片相對電導率變化Figure 1 Changes of relative conducitivity in leaves of six cultivars of O. fragrans under cold stress

半致死溫度(TL50)在一定程度上能反映植物不同品種的耐寒能力。對相對電導率數(shù)據(jù)進行 Logistic回歸分析(表1)，相關系數(shù)均大于0.8，擬合度良好，結果可信。通過公式TL50=lna/b(a、b為回歸方程的參數(shù))計算半致死溫度，不同品種彩葉桂抗寒性從大到小依次為‘傲霜’ ‘冬榮’ ‘羅彩2號’‘羅彩1號’ ‘永?；貌省?‘銀碧雙輝’。

表1 低溫脅迫下各品種葉片相對電導率的回歸方程和半致死溫度Table 1 Regression equation of relative conductivity and TL50 in leaves of six cultivars of O. fragrans under cold stress

2.2 低溫脅迫對 6個彩葉桂品種葉片丙二醛質(zhì)量摩爾濃度的影響

低溫脅迫下，彩葉桂葉片丙二醛質(zhì)量摩爾濃度隨溫度降低，總體上呈先增加后減少再增加的變化規(guī)律，并且各品種的變化幅度有所不同(圖2)。0 ℃時葉片中丙二醛與對照相比顯著上升，隨即出現(xiàn)下降，僅‘傲霜’在0 ℃時出現(xiàn)短暫下降，隨后又迅速上升，直到?12 ℃才又出現(xiàn)下降。隨著脅迫的加深，各品種在降溫后期丙二醛質(zhì)量摩爾濃度再次呈上升趨勢。上升幅度最大的為‘銀碧雙輝’，是對照的2.34倍，上升幅度最小的是‘傲霜’，是對照的0.88倍。

圖2 低溫脅迫下各品種葉片丙二醛質(zhì)量摩爾濃度變化Figure 2 Changes of MDA content in leaves of six cultivars of O.fragrans under cold stress

2.3 低溫脅迫對 6個彩葉桂品種葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

在對彩葉桂葉片進行人工低溫處理時，各品種可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)總體上均表現(xiàn)出“升高—降低”的變化趨勢，但增加幅度和拐點溫度并不相同(圖3和圖4)。‘永福幻彩’可溶性糖拐點溫度最低，為?12 ℃，‘銀碧雙輝’和‘冬榮’拐點溫度最高，為0 ℃；可溶性糖增幅最大的是‘傲霜’，是對照的1.61倍，增幅最小的為‘銀碧雙輝’，是對照的1.06倍?！_彩1號’可溶性蛋白質(zhì)拐點溫度最低，為?12 ℃，‘永福幻彩’‘羅彩2號’拐點溫度最高，為0 ℃；可溶性蛋白質(zhì)增幅最大的是‘冬榮’，是對照的2.66倍，增幅最小的是‘羅彩2號’，是對照的1.15倍?？偟膩碚f，當彩葉桂受到一定范圍的低溫脅迫時，可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)表現(xiàn)為增加，即2個指標和植物的耐寒能力存在一定的正相關。

圖3 低溫脅迫下各品種葉片可溶性糖變化Figure 3 Changes of soluble sugar content in leaves of six cultivars of O. fragrans under cold stress

圖4 低溫脅迫下各品種葉片可溶性蛋白質(zhì)變化Figure 4 Changes of soluble protein content in leaves of six cultivars of O. fragrans under cold stress

2.4 低溫脅迫對6個彩葉桂品種葉片保護酶活性的影響

圖5顯示：隨著低溫脅迫強度增加，各品種超氧化物歧化酶活性變化趨勢大體分“單峰”和“雙峰”2種形式，但不同品種的峰值所對應的溫度和增長幅度不同?！_彩1號’ ‘傲霜’葉片中超氧化物歧化酶活性呈現(xiàn)出“升—降—升—降”的雙峰曲線。這2個品種第1個峰值所對應的溫度均為?4 ℃，第2個峰值對應的溫度分別為?12和?20 ℃；其余各品種均呈先上升后下降的單峰曲線，其中‘冬榮’峰值所對應的溫度最低，為?12 ℃，‘永?；貌省逯邓鶎臏囟容^高，為0 ℃。各品種中，增幅最大的是‘羅彩1號’，是對照的2.17倍，增幅最小的是‘傲霜’，是對照的1.62倍。一般來說，低溫脅迫會使植株超氧化物歧化酶活性提高，其增幅與植物自身耐寒能力高低具有正相關性。

圖5 低溫脅迫下各品種葉片超氧化物歧化酶活性變化Figure 5 Changes of SOD activity in leaves of six cultivars of O.fragrans under cold stress

圖6顯示：不同品種過氧化物酶活性隨溫度變化趨勢也大致分為2種類型?！栏；貌省?‘銀碧雙輝’大致呈“上升—下降”的趨勢，兩者達到最大值時臨界溫度均為?8 ℃，但增幅各不相同，峰值時的過氧化物酶活性分別是對照的3.03、4.69倍；‘羅彩1號’ ‘羅彩2號’ ‘傲霜’ ‘冬榮’過氧化物酶活性呈“下降—上升—下降”的趨勢，在0 ℃時過氧化物酶活性均出現(xiàn)短暫下降，隨后立即上升，分別在?4、?8、?4、?12 ℃時達到最大值，此時過氧化物酶活性分別是對照的1.12、1.42、1.31、1.19、1.15倍；當溫度進一步降低時(?12～?28 ℃)，各品種過氧化物酶活性又出現(xiàn)大幅度下降。一般來說，過氧化物酶活性的上升幅度與植物的耐寒能力正相關。

圖6 低溫脅迫下各品種葉片過氧化物酶活性變化Figure 6 Changes of POD activity in leaves of six cultivars of O.fragrans under cold stress

2.5 隸屬函數(shù)法綜合評價6個彩葉桂品種的抗寒性

采用Excel 2016，依據(jù)隸屬函數(shù)計算公式得出6個品種各指標的隸屬函數(shù)值，并取平均值，通過比較隸屬函數(shù)平均值大小得出6個品種的抗寒性從強到弱依次為 ‘傲霜’ ‘冬榮’ ‘羅彩2號’ ‘羅彩1號’ ‘永福幻彩’ ‘銀碧雙輝’(表2)。

表2 6 個彩葉桂品種抗寒性綜合評價Table 2 Comprehensive evaluation of cold resistance of six cultivars of O. fragrans

3 討論

植物組織的相對電導率變化能夠在一定程度上反映細胞膜的受損情況，是檢測植物耐寒性的較為快速和準確的指標[11]。在植物抗寒性評價中常采用電導法，并與 Logistic 方程結合即能夠較簡便地篩選出抗性較強的品種[10]。本研究得出：各品種葉片相對電導率隨溫度的降低而不斷增大，總體呈“S”曲線增長，不同品種的變化幅度有所差異，與桂花[12]、蘋果Malus pumila[13]、柑橘Citrus reticulata[14]、繡線菊Spiraea salicifolia[15]、楨楠Phoebe zhennan[16]等植物的結果一致。將6個彩葉桂品種相對電導率擬合Logistic方程計算得到各品種的半致死溫度并進行抗寒性排序，結果與隸屬函數(shù)法進行抗寒性綜合評價的結果相同，可見通過半致死溫度來判斷此6個彩葉桂品種抗寒性是可靠的。這在木瓜屬Pseudocydonia[17]、衛(wèi)矛屬Euonymus[11]等植物中也得到了驗證。

逆境脅迫下，丙二醛質(zhì)量摩爾濃度明顯升高[18]。本研究發(fā)現(xiàn)：隨著低溫脅迫程度的加重，6個彩葉桂品種葉片丙二醛質(zhì)量摩爾濃度呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢，并且在降溫初始階段就開始迅速上升，這與相思樹Acacia[19]的結果一致。說明突然低溫使膜脂發(fā)生過氧化，膜系統(tǒng)受到損傷。隨著溫度進一步降低，丙二醛質(zhì)量摩爾濃度出現(xiàn)一定的下降?？梢娺m宜的低溫鍛煉能夠維持丙二醛質(zhì)量摩爾濃度的相對穩(wěn)定，緩解膜系統(tǒng)遭受的損害，推測此時植物體通過調(diào)動自身的調(diào)節(jié)機制如增加抗氧化酶的活性等來緩解損傷。對照超氧化物歧化酶活性變化情況來看，此時葉片的超氧化物歧化酶活性處于較高水平，這也可以證明此推測。隨著低溫脅迫的加深，葉片內(nèi)丙二醛質(zhì)量摩爾濃度再次上升，表明彩葉桂葉片細胞膜脂過氧化程度隨溫度的進一步降低而逐漸加深，這時植株的受損程度已經(jīng)較為嚴重，僅依靠自身已經(jīng)很難調(diào)節(jié)。

低溫環(huán)境中植物細胞會大量積累各類滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)等)，其增加幅度和積累速度與自身抗寒性密切相關，抗寒性越強的植物增幅越大[20?21]。在對彩葉桂葉片進行人工低溫處理時，各品種可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)總體上均表現(xiàn)出“升高—降低”的變化趨勢，但增加幅度和拐點溫度并不相同，這與北美冬青Ilex verticillata[18]、8種常綠闊葉樹[22]的研究結果類似。推測在降溫初期，植物體的滲透調(diào)節(jié)機制被誘發(fā)，植物能夠合成更多的可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)，以降低細胞滲透勢，改善自身抗寒能力；溫度進一步降低時，該防御機制受到影響，葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量開始減少?？偟膩碚f，各彩葉桂品種對于低溫脅迫造成的傷害均具備一定的防御能力，它們在低溫脅迫下可以合成更多的可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，通過提高細胞液濃度，維持細胞內(nèi)外滲透壓的平衡，以應對低溫脅迫造成的傷害，但在不同品種間這種防御能力有所差異。

超氧化物歧化酶與過氧化物酶是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶。植物遭受低溫脅迫時，抗氧化酶活性上升[23?25]。本研究中隨著低溫脅迫強度的增加，各品種間超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性的變化有所不同?！_彩2號’ ‘冬榮’的超氧化物歧化酶活性及‘永福幻彩’ ‘銀碧雙輝’超氧化物歧化酶與過氧化物酶活性均呈先上升后下降的趨勢，但不同彩葉桂品種超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性最大值所對應的溫度和增長的幅度各不相同。在降溫初期，2種酶活性均有一定程度的增加趨勢，可見植株對初期微弱的低溫即產(chǎn)生了一定的防御能力來緩解損傷的速度和程度，證明了超氧化物歧化酶、過氧化物酶具有保護植物抵御低溫脅迫的功能。隨著溫度的繼續(xù)降低，脅迫進一步加深，即超氧陰離子自由基大量累積，超出了植物自身防御系統(tǒng)的清除能力，而且保護酶系統(tǒng)被破壞，超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性急劇下降。本研究結果與蘋果砧木[26]、野生柑橘[27]、黃連木Pistacia chinensis和黃山欒樹Koelreuteria integrifoliola[28]的結果一致?！_彩1號’‘傲霜’葉片中超氧化物歧化酶活性表現(xiàn)出“上升—下降—再上升—再下降”的趨勢，中間出現(xiàn)波動的原因可能是隨著溫度的進一步降低，植物的防御機制受到輕微破壞，體內(nèi)超氧化物歧化酶活性出現(xiàn)降低，自由基大量積累，葉片受害加深。隨著脅迫的加深，超氧化物歧化酶活性有回升的趨勢，但很快到達保護極限，之后再次下降。本研究結果與葡萄Vitisvinifera[29]、楊桃Averrhoa carambola[30]的研究結果一致?！_彩1號’‘羅彩2號’‘傲霜’‘冬榮’過氧化物酶活性呈“下降—上升—下降”的趨勢，在降溫初期過氧化物酶活性即出現(xiàn)降低的原因可能是低溫脅迫已經(jīng)對植株產(chǎn)生了輕微的損傷，當溫度繼續(xù)下降時(0～?12 ℃)，植株過氧化物酶活性有一定回升，說明植物體能夠借助自身的調(diào)節(jié)來減輕逆境所造成的傷害。隨著溫度的進一步下降(?12～?28 ℃)，低溫脅迫對植物的損傷已經(jīng)超越了植物體自我調(diào)節(jié)能力的限度，過氧化物酶活性便再次下降。本研究結果與葡萄[31]、多脈含笑Michelia coriacea[32]的結果一致。

綜上所述，低溫脅迫條件下，6個彩葉桂品種葉片生理生化指標發(fā)生了明顯的變化。據(jù)其變化趨勢推測彩葉桂應對低溫脅迫的作用機制主要為：一是通過合成和積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來提高細胞內(nèi)的滲透勢，二是通過抗氧化酶清除逆境下過多的活性氧自由基。隸屬函數(shù)法[10]可以克服單一生理指標的片面性，能夠更加全面地反映植物的實際抗寒性，得到更為準確可靠的評價結果。目前，隸屬函數(shù)法已經(jīng)在毛桃Amygdalus persica[33]、枇杷Eriobotrya japonica[34]、非洲菊Gerbera jamesonii[35]等植物的抗寒性研究上廣泛應用。采用隸屬函數(shù)法綜合評價6個彩葉桂品種的抗寒能力，強弱順序依次為‘傲霜’ ‘冬榮’‘羅彩2號’ ‘羅彩1號’ ‘永福幻彩’ ‘銀碧雙輝’。這與各品種田間越冬表現(xiàn)觀察結果較為一致，其中‘傲霜’‘冬榮’‘羅彩2號’這3個品種較能適應北方氣候。