黃林玲，周 湘，胡加付，林海萍，郭 愷

（浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 生物農(nóng)藥高效制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，浙江 杭州 311300）

松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus是公認(rèn)的檢疫性有害生物，破壞性地危害歐亞地區(qū)的松林資源[1]。松材線蟲的生活史分為2個階段：繁殖階段和擴散階段[2]。在溫度適宜的夏季和秋季，松材線蟲進入繁殖階段，在樹體內(nèi)經(jīng)過卵、繁殖型幼蟲(J1～J4)，再發(fā)育為成蟲。在不良環(huán)境條件下，松材線蟲進入擴散階段，即滯育型周期，繁殖型J2會轉(zhuǎn)型發(fā)育為擴散型J3幼蟲和擴散型J4幼蟲，在此過程中體內(nèi)脂滴數(shù)量增加，并發(fā)生脂滴融合現(xiàn)象，形成超大脂滴或者塊狀脂肪[3]。擴散型J4幼蟲口針退化不取食，依靠消耗體內(nèi)超大脂滴作為能量侵染新的寄主植物。因此，脂滴對于松材線蟲的生存和傳播都具有重要作用。中性脂肪(甘油三酯和膽固醇)在線蟲中主要以脂滴的形式存在，是松材線蟲體內(nèi)脂肪的主要儲存形式[4?6]。松材線蟲的腸道是脂類物質(zhì)沉積的主要場所。由于線蟲蟲體是透明的，可在顯微鏡下清楚地看到從頭部到尾部的整個腸道，是研究脂肪沉積的一種理想模型[7]。模式線蟲秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans可采用染料蘇丹黑B、尼羅紅和油紅O等方法檢測脂肪儲存和代謝，不同染色方法下脂肪含量的表征呈現(xiàn)一定程度的差異。利用脂溶性的染料蘇丹黑B來著色脂滴，脂滴在腸和皮下組織中可見。熒光染料尼羅紅和油紅O可將脂滴染成紅色[8]。目前在松材線蟲中尚無相關(guān)脂滴染色研究報道，因此，本研究使用不同的染料標(biāo)記松材線蟲體內(nèi)的脂滴分布，通過使用ImageJ軟件測量線蟲脂滴的平均像素強度，來表征脂肪含量，確定適合松材線蟲脂滴染色的方法[9]。

1 材料和方法

1.1 供試線蟲和培養(yǎng)條件

松材線蟲NXY61蟲株為中國林業(yè)科學(xué)院森林保護研究所從浙江省寧波市罹病馬尾松Pinus massoniana中分離獲得。使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)培養(yǎng)的灰葡萄孢Botrytis cinerea來培養(yǎng)繁殖型松材線蟲[2]。混合齡期的繁殖型線蟲置于PDA培養(yǎng)基上生長3 d，在加入滅菌雙蒸水(ddH2O)的貝爾曼漏斗中將線蟲從培養(yǎng)基上洗下來，3 000 r·min?1離心3 min，清除上清液。擴散型3齡幼蟲從當(dāng)年采集的疫木中分離，擴散型4齡幼蟲從媒介昆蟲松墨天牛Monochamus alternatus體內(nèi)分離。

1.2 染色

1.2.1 蘇丹黑 B染色 將松材線蟲用 M9緩沖液 (3.00 g KH2PO4, 6.00 g Na2HPO4, 5.00 g NaCl, 1 mL 1 mol·L?1MgSO4，加入蒸餾水定容至 1 L)洗滌離心 3次 (3 000 r·min?1，1 min)；將線蟲置于含體積分?jǐn)?shù)為 1% 多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)的M9緩沖液中，4 ℃過夜；?80 ℃冰箱凍融3次；將M9洗滌固定的線蟲經(jīng)梯度體積分?jǐn)?shù)乙醇(25%，50%和70%)分級脫水，每級5 min；隨后，在溶于體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇的蘇丹黑B溶液中進行染色[10]。顯微鏡觀察和拍攝染色后的線蟲，并對皮下和腸道內(nèi)染色的脂滴像素統(tǒng)計。

1.2.2 尼羅紅染色 將線蟲用體積分?jǐn)?shù)為1%多聚甲醛溶液固定，使線蟲細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定狀態(tài)[9]。線蟲和多聚甲醛溶液混合，并于室溫?fù)u動2～3 h后，靜置使線蟲沉降；在?80 ℃冰箱凍融3次，固定后的線蟲逐級脫水；在M9緩沖液的線蟲沉淀中加入1 mL尼羅紅(1 mg·L?1)，在避光的環(huán)境下混勻并染色25～30 min，染色期間輕輕翻轉(zhuǎn)離心管，使得蟲體均勻接觸染料；用1×PBS(8.00 g NaCl，0.20 g KCl，1.44 g Na2HPO4和 0.24 g KH2PO4，溶于 800 mL 蒸餾水，用 HCl調(diào)節(jié)溶液 pH 至 7.4，最后加蒸餾水定容至1 L)清洗1次，去除線蟲表面的染料，然后使線蟲自然沉降。最后用顯微鏡觀察拍照。

1.2.3 油紅O染色 用M9緩沖液將松材線蟲洗至離心管中，在體積分?jǐn)?shù)為1%多聚甲醛室溫或4 ℃固定 15～30 min；然后置于?80 ℃ 冰箱中冷凍 15 min，在 43 ℃ 水浴中迅速解凍；低速離心 1 min，棄上清；用1×PBS沖洗3次，棄去PBS；用體積分?jǐn)?shù)為1%Triton X-100、異丙醇油紅O溶液浸泡30 min；用1×PBS沖洗3次。用異丙醇置于載玻片上，顯微鏡下觀察拍照[11]。

1.2.4 后置油紅O染色 使用改良的后置油紅O染色方案[12]。將油紅O溶于異丙醇，制成質(zhì)量濃度為5.00 g·L?1原液。采用混合法制備油紅O工作液(60%的原液和40%的水)。油紅O工作液靜置后用0.22 mm自旋過濾器過濾。將線蟲用體積分?jǐn)?shù)為1%多聚甲醛/PBS在室溫下固定搖動30 min；然后立即將樣品在冰箱中冷凍干燥15 min，并在自來水中溶解，共3次；低速離心1 min，棄上清；用1×PBS洗滌樣品3次，用體積分?jǐn)?shù)為60%異丙醇脫水2 min；用1 mL油紅O工作液搖動1 h進行染色。染色后的樣品用1×PBS洗滌3次，再水合1×PBS，并安裝在瓊脂填充的載玻片上，顯微鏡觀察拍照。

1.3 顯微鏡和成像

用徠卡熒光正置顯微鏡(DM4B)使用40×物鏡觀察固定的尼羅紅、油紅O和蘇丹黑B染色的線蟲，用CCD相機(DFC7000T)拍攝16位圖像，并用ImageJ(V2.1.4.7)進行圖像處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘇丹黑B和尼羅紅固定染色線蟲效果

將固定后的蟲體置于顯微鏡下觀察，與未染色線蟲相比，蘇丹黑B染色線蟲的腸道普遍被染成藍色(圖1)。在實驗過程中，用蘇丹黑B原溶液染色線蟲如圖1A～B，顯微鏡下觀察到的脂滴邊界不清晰，整條成蟲呈現(xiàn)深藍色；將蘇丹黑B稀釋60%，染色觀察如圖1C～D，幼蟲和成蟲脂滴邊界尚清楚，但仍會影響觀察松材線蟲的脂滴動態(tài)變化。

尼羅紅與蘇丹黑B共同標(biāo)記了腸道周圍的脂滴。尼羅紅染色線蟲在顯微鏡下觀察到部分脂滴呈淺紅色(圖1E～H)。將配置的母液染料稀釋500倍，染色時間30 min，顯微成像效果不佳(圖1E～F)，大部分蟲體脂滴染色不均，其中成蟲的色澤較淺。當(dāng)提高工作液濃度，僅將母液稀釋了100倍，為5 mg·L?1,并將染色時間增加為1 h (圖1G～J)，可以分辨分布在成蟲腸道周圍的圓形大脂滴，而幼蟲的脂滴邊界相對比較模糊，不便于測量松材線蟲脂滴的大小和脂肪存儲量。

圖1 蘇丹黑 B、尼羅河紅染色線蟲中相同脂滴Figure 1 Sudan black B, fixed Nile red stained nematode in same lipid droplets

2.2 油紅O和后置油紅O染色線蟲效果

在用油紅O與后置油紅O染色線蟲時，培養(yǎng)的同步發(fā)育繁殖型線蟲和野外采集的擴散型線蟲都呈現(xiàn)明顯的紅色脂滴(圖2)。油紅O染色如圖2A～D，可以觀察到，當(dāng)蟲體內(nèi)出現(xiàn)較多脂滴時，單個脂滴未能良好分離，會影響測量松材線蟲脂肪儲存量化及繁殖型與擴散型松材線蟲的脂滴大小的變化。用后置油紅O方法染色線蟲結(jié)果如圖2E～J，在顯微鏡下觀察到脂滴邊界清晰，其中J2和J3幼蟲大部分較小的脂滴分布在腸道和表皮，并能觀察到從幼蟲J4到成蟲出現(xiàn)小脂滴聚集成大脂滴的現(xiàn)象。擴散型J3較大的脂肪塊與擴散型J4脂質(zhì)小滴之間的脂滴大小變化十分明顯。

圖2 油紅 O、后置油紅 O 染色線蟲中相同脂滴Figure 2 Oil red O，post-fix oil red O stained the same lipid droplets in B. xylophilus

2.3 脂滴染色圖片像素強度比較

通過光學(xué)顯微鏡捕獲的蘇丹黑B、尼羅紅、油紅O染色松材線蟲脂滴圖片，用ImageJ進行圖像處理，計算線蟲脂滴圖片的平均像素強度。圖3結(jié)果顯示：蘇丹黑B和后置油紅O染色松材線蟲脂滴的平均像素強度明顯高于尼羅紅和油紅O染色，其中蘇丹黑B染色后整條蟲呈現(xiàn)藍色，所以脂滴平均像素強度最高，而尼羅紅的最低，因為顏色較淺。這就說明脂滴平均像素強度偏高或偏低都會影響表征脂肪。經(jīng)ImageJ圖像處理比較分析，后置油紅O染色脂滴經(jīng)計算轉(zhuǎn)換與原始圖像的一致，具有單個脂滴的良好分離(圖4)。

2.4 松材線蟲 4種脂滴染色方法的比較

如表1所示：綜合考慮染色方法的簡易性、染色時間的長短[11]、染色的觀察效果，后置油紅O染色方法在4種染色方法中的染色時間相對較短，脂滴呈現(xiàn)的效果比較清晰，能實現(xiàn)脂滴的單個分離，方法步驟比較簡單，認(rèn)為后置油紅O染色方法是松材線蟲脂滴的最佳染色方法。

3 結(jié)論與討論

本研究通過使用染料標(biāo)記的不同測定法來探索松材線蟲的最佳脂滴染色方法。在染色前，需要先對蟲體進行有效固定，多聚甲醛可很好地保存生物體組織的細(xì)微結(jié)構(gòu)特征。固定以后，組織中的各種物質(zhì)會沉淀和凝固，產(chǎn)生不同的折射率，促使產(chǎn)生光學(xué)差異，方便染色后觀察。

油紅O、蘇丹黑B、尼羅紅染色一般都能觀察到線蟲體內(nèi)脂肪儲存，但在本研究中呈現(xiàn)不同顯色效果。蘇丹黑B作為一種經(jīng)典的染料，在固定過程中經(jīng)乙醇的洗滌，無法標(biāo)記線蟲中脂肪儲存[9]。本研究也發(fā)現(xiàn)：蘇丹黑B染色松材線蟲脂滴觀察效果不佳，染色時間也比較長。尼羅紅是一種由尼古藍衍生的脂類染料，在疏水環(huán)境時發(fā)熒光，既可染色脂滴，又可檢查完整活體動物的脂肪含量[13?15]，經(jīng)常被作為秀麗隱桿線蟲的脂肪酸代謝研究的染料標(biāo)記。最近研究還發(fā)現(xiàn)，鮮活的線蟲經(jīng)尼羅紅染色沒有顯示染色模式的差異[12]。當(dāng)線蟲被喂食尼羅紅時，染料會在與溶酶體有關(guān)的細(xì)胞器中積聚[16]，固定尼羅紅比喂食尼羅紅更能顯示脂肪儲存情況。本研究初期觀察到的脂滴色澤非常淺，甚至整條線蟲未被染色，呈透明狀態(tài)，經(jīng)過多步實驗探索，線蟲中脂滴有部分染色，但仍有染色不完整的脂滴。而且由于尼羅紅是親水性染料，可能會染色脂褐素，導(dǎo)致固定染色不能將中性脂肪存儲區(qū)與脂褐素區(qū)分開，影響結(jié)果[17]。油紅O是一種油溶性偶氮染料，溶于乙醇和丙酮，在脂肪內(nèi)能高度溶解，從而染色，顏色比較鮮紅，染色效果相對于前面2種染料要好。后置油紅O染色用體積分?jǐn)?shù)為1%多聚甲醛的固定液在分子雜交爐中室溫條件搖動30 min，通過搖動，使線蟲充分接觸固定液。將樣品放在?80 ℃冰箱中凍融3次，并在自來水中溶解，相比于油紅O染色(在43 ℃水浴中迅速解凍)，可增加線蟲的緩沖性。在后置油紅O染色過程中，異丙醇脫水使線蟲顯微成像時觀察到的組織結(jié)構(gòu)更清晰，用自旋過濾器過濾油紅O工作液，可以減少沉淀雜質(zhì)的產(chǎn)生。用瓊脂填充幻燈片成像，可以防止線蟲干死，也可以更好地固定已染色的線蟲。經(jīng)過多次實驗探究，油紅O染色之后，觀察到的大小脂滴聚集，脂滴邊界未能體現(xiàn)，紅色會成片區(qū)域出現(xiàn)，當(dāng)測量脂滴大小變化、脂滴數(shù)量時，會加大實驗數(shù)據(jù)誤差；后置油紅O染色方法經(jīng)過改良，線蟲在室溫下用體積分?jǐn)?shù)為1%多聚甲醛搖動，并經(jīng)多次凍融以后用體積分?jǐn)?shù)為60%的異丙醇脫水，染色效果比較理想，可直接觀察脂滴大小變化。綜上所述，后置油紅O染色方法是最佳松材線蟲脂滴染色方法。