吳 芳，龔 殊，嚴(yán)曉平

(1.宜賓學(xué)院質(zhì)量管理與檢驗(yàn)檢測學(xué)部，四川 宜賓 644000； 2.中儲糧成都儲藏研究院有限公司，四川 成都 610091)

鞘翅目象甲科儲糧害蟲包括闊鼻谷象、羅望子象、谷象、米象和玉米象[1]，其中谷象屬的米象、玉米象和谷象是世界分布的儲糧大害蟲[1-2]，尤其是玉米象為頭號儲糧大害蟲[1]。米象和玉米象由于形態(tài)和生態(tài)分布都非常接近，僅僅從形態(tài)上對它們進(jìn)行鑒別非常困難。探索新的方法彌補(bǔ)形態(tài)鑒定的不足顯得尤為重要[3]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)在昆蟲分類中的廣泛應(yīng)用，為儲糧害蟲的快速準(zhǔn)確鑒定提供了新的方法。線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(mtDNACOⅠ)基因是目前測序最多，結(jié)構(gòu)和動力學(xué)研究最為清楚的基因之一，其結(jié)構(gòu)相對保守，種間變異較多，能夠提供豐富的系統(tǒng)發(fā)育信息，自Hebert等[3]首次提出利用線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ基因作為DNA條形碼以來，該技術(shù)已在鱗翅目[4-6]、鞘翅目[7-8]、半翅目[9]、等翅目[10]和彈尾目[11]昆蟲的分類鑒定中得到廣泛應(yīng)用。近年，該技術(shù)開始在儲糧害蟲書虱[12-13]、扁甲類[14-15]、象甲類[16]的鑒定方面得到應(yīng)用。本研究以3種常見象甲類儲糧害蟲為研究對象，對其COⅠ基因片段進(jìn)行研究，以期實(shí)現(xiàn)DNA條形碼技術(shù)對儲糧象甲種類的快速鑒定，彌補(bǔ)形態(tài)鑒別存在的不足。

1 材料與方法

1.1 研究材料

供試材料為采自中國、印度、泰國、澳大利亞和德國5個(gè)國家的米象、玉米象和谷象，共38個(gè)樣本，以采自四川峨眉的苜蓿葉象作為參照擴(kuò)增，標(biāo)本原始采集地見表1。所有樣本都經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，保存于中國儲糧害蟲防治應(yīng)用技術(shù)研究中心-20℃低溫冰箱中。另外，在GenBank上檢索了儲糧象甲類的所有COⅠ基因序列用于比對分析(截止2017-02-28)，包括米象COⅠ基因序列8條，玉米象87條，谷象3條，羅望子象1條，闊鼻谷象1條。選取儲糧害蟲赤擬谷盜為外群[17]。

1.2 基因組DNA提取

采用試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取供試儲糧象甲的總DNA，具體提取方法依照試劑盒使用說明書。

1.3 COⅠ基因擴(kuò)增

選用Folmer等[18]的通用引物，由上海派森諾生物科技股份有限公司合成，上游引物L(fēng)CO1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)，下游引物HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)，產(chǎn)物大小約700 bp。

PCR擴(kuò)增采用50 μl反應(yīng)體系；象甲DNA模板5 μl，10×Buffer 5 μl，dNTPs 2 μl，10×Taq酶1 μl，引物各10 μl，引物濃度為10 μmol/L。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；然后按以下反應(yīng)條件進(jìn)行35個(gè)循環(huán)：95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸45 s；最后72℃延伸7 min。

1.4 PCR產(chǎn)物檢測與測序

供試樣品及原始采集地見表1。

表1 供試樣品及原始采集地

產(chǎn)物檢測：取5 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，電泳條件120 V，約30 min。電泳結(jié)束后溴化乙錠(EB)染色10 min，用凝膠成像系統(tǒng)Gel-Doc Universal Hood II分析電泳結(jié)果，檢測合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用于后續(xù)分析。

產(chǎn)物的純化與測序：PCR產(chǎn)物的純化與測序均委托上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行，凝膠回收按照康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司AxyPreP DNA凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行，測序反應(yīng)在3730XL DNA Analyser(ABI)測序儀上進(jìn)行。

1.5 序列處理及分析

序列通過Chromas軟件讀取，并對每個(gè)測序結(jié)果進(jìn)行人工逐堿基讀取和反復(fù)校對，確保序列的高質(zhì)量，序列整合處理用BioEdit軟件，對齊處理用ClustalW Multiple Alignment軟件。將確定好的序列利用NCBI中的BLAST進(jìn)行相似性檢索，進(jìn)行比對和同源基因的下載，然后將自測序COⅠ基因序列以及從GenBank下載的象甲科害蟲基因序列用DNAMAN軟件進(jìn)行多重比對，將比對結(jié)果保存為FASTA格式。利用DnaSP軟件統(tǒng)計(jì)單倍型，序列相同作為同一單倍型(haplotype)，忽略插入與缺失位點(diǎn)。將比對結(jié)果導(dǎo)入MEGA軟件，利用Kimura雙參數(shù)法計(jì)算遺傳距離[14]并計(jì)算轉(zhuǎn)換和顛換值及其比值(R值)，保守位點(diǎn)及變異位點(diǎn)，并且應(yīng)用K2P遺傳距離模型的鄰接法構(gòu)建進(jìn)化系統(tǒng)樹，系統(tǒng)發(fā)育樹分支的置信度采用自展法(bootstrap analysis BP)重復(fù)檢測1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

2.1.1自測序列

通過對來自38個(gè)來源地的3種象甲樣品的COⅠ基因進(jìn)行擴(kuò)增和測序，總共得到68條長度約為700 bp的清晰單一目標(biāo)片段。在NCBI中利用BLAST進(jìn)行同源性比對，結(jié)果表明，3種象甲COⅠ基因序列分別與數(shù)據(jù)庫中靶標(biāo)種類基因片段的同源性為99%～100%，與形態(tài)鑒定結(jié)果一致，表明所獲得的COⅠ基因序列準(zhǔn)確可靠。利用DnaSP軟件統(tǒng)計(jì)單倍型，3種儲糧象甲的單倍型情況見表2。米象包含H1、H2、H3、H4、H5和H66種單倍型，其中H1、H2、H3和H4分別為來源于澳大利亞、四川廣漢、四川十陵和四川三臺樣品所特有，H5為11個(gè)來源地樣品所共有，H6為9個(gè)來源地的樣品共有；所有玉米象單倍型類型為H7，為13個(gè)來源地樣品所共有；谷象含H81種單倍型。各種單倍型分布情況見表2，可以看出，單倍型類型和樣品來源地之間沒有關(guān)系。從各種單倍型中選取1個(gè)序列用于后續(xù)分析，具體序列為基因登錄號為KY887564、KY887566、KY887567、KY887568、KY887569、KY887570、KY887571、KY887572的8條序列。

2.1.2GenBank獲取序列

在GenBank中通過序列比對獲取的3種象甲的COⅠ基因同源序列為：米象8條、玉米象86條、谷象3條，利用DnaSP進(jìn)行單倍型統(tǒng)計(jì)，GenBank中3種象甲科儲糧害蟲COⅠ基因單倍型為：玉米象3種單倍型，米象2種單倍型，谷象1種單倍型，根據(jù)得到的單倍型，每種選取1個(gè)基因序列用于后續(xù)分析。另外在GenBank下載到象甲科儲糧害蟲的羅望子象COⅠ基因序列1條，闊鼻谷象COⅠ基因序列1條，GenBank中下載序列共9條(見表3)。以赤擬谷盜為外源種。

表3 NCBI上下載的儲糧害蟲CO Ⅰ基因單倍型數(shù)量及代表序列號

2.2 COⅠ基因序列組成和變異

自測序列和下載的序列剪切成等長426 bp片段，MEGA軟件分析結(jié)果表明，未發(fā)現(xiàn)堿基的缺失和插入。變異位點(diǎn)193個(gè)，保守位點(diǎn)233個(gè)，簡約信息位點(diǎn)126個(gè)，自裔位點(diǎn)55個(gè)。所有位點(diǎn)中，A、G、C和T的堿基平均含量分別為29.8%、14.7%、20.6%和35.0%，A+T含量較高，為64.7%，G+C含量35.3%，表現(xiàn)明顯的A+T堿基偏嗜，且A與T含量相當(dāng)，符合昆蟲線粒體基因組成的基本特征[19]。

2.3 堿基替換分析

全體位點(diǎn)及各位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換與顛換值以及其比值結(jié)果如表4，全體位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換主要發(fā)生在T/C間，顛換發(fā)生在A/T間，轉(zhuǎn)換/顛換為0.97。轉(zhuǎn)換與顛換在密碼子各位點(diǎn)發(fā)生比例接近，且轉(zhuǎn)換與顛換值相當(dāng)，第1，2和3位點(diǎn)的R(轉(zhuǎn)換/顛換)值分別為1.04、0.85和1.03。無論整體還是密碼子各位點(diǎn)，其R值都小于2，說明該段序列的轉(zhuǎn)換與顛換未達(dá)飽和，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時(shí)應(yīng)考慮轉(zhuǎn)換與顛換發(fā)生的比率，另外說明該段基因可靠程度高，使用該基因構(gòu)建進(jìn)化樹可靠。

表4 核苷酸堿基替換值

2.4 遺傳距離分析

考慮堿基的轉(zhuǎn)換與顛換，采用bootstrap值(1 000)進(jìn)行檢驗(yàn)，MEGA中的Kimura雙參數(shù)法遺傳距離計(jì)算結(jié)果見表5。

表5 象甲COⅠ基因序列Kimura雙參數(shù)法遺傳距離

由表5可知，種內(nèi)和種間遺傳距離存在明顯差異。種內(nèi)遺傳距離為0.000～0.007，種內(nèi)平均遺傳距離為0.003 4，種間遺傳距離為0.163～0.207，種間平均遺傳距離0.193 2，本研究中3種象甲種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的56倍，滿足DNA條形碼有效性的建議標(biāo)準(zhǔn)，與Hebert等[6]研究理論一致，認(rèn)為98%的種內(nèi)遺傳距離差異為0～2%，種間遺傳距離差異平均可達(dá)11.3%。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用鄰接法對象甲COⅠ基因序列建系統(tǒng)發(fā)育樹，聚類結(jié)果如圖1。

由圖1可以看出，3種象甲的同一種不同單倍型聚為一支，分支自展值均為100%，不同種的種類被明顯區(qū)分開，聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，說明該段序列能夠作為3種象甲分子鑒定的依據(jù)。

3 討論

米象、玉米象和谷象是3種重要的儲糧象甲類害蟲[2]，谷象因鞘翅無斑點(diǎn)、后翅退化、不能飛等特點(diǎn)易于米象與玉米象從形態(tài)上進(jìn)行區(qū)分[2]，米象和玉米象通過形態(tài)鑒別非常困難，雖然二者可以通過個(gè)體大小、食性偏好、不親和性、前胸背板和生殖器等加以區(qū)分[20]，但最可靠的是通過解剖它們的生殖器加以鑒別[20]，這對非從事分類的專業(yè)人員而言非常困難。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，其在米象和玉米象的鑒別方面也得到廣泛應(yīng)用，Hidayat等[20]運(yùn)用RAPD和RFLP技術(shù)對米象和玉米象進(jìn)行了成功鑒別，但是這些方法可重復(fù)性差并且價(jià)格昂貴[21]，Peng等[22]通過設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增ITS-2區(qū)對實(shí)驗(yàn)室米象和玉米象品系進(jìn)行了區(qū)分，然而他們并沒對別的種群和該方法的有效性進(jìn)行驗(yàn)證。

分支處數(shù)值表示重復(fù)1 000次后的自展值(>50%)，標(biāo)尺示遺傳距離。

在本研究中，利用DNA條形碼技術(shù)成功對3種儲糧象甲進(jìn)行了種的區(qū)分，參照Napole?o等[23]的方法，通過分析目的片段種內(nèi)和種間遺傳距離，對將COⅠ基因作為3種儲糧象甲種類鑒定的DNA條形碼的有效性進(jìn)行了分析和評估。好的DNA條形碼種間變異應(yīng)大于種內(nèi)變異，COⅠ基因種間遺傳距離平均值至少應(yīng)該是種內(nèi)遺傳距離平均值的10倍[6]，本研究結(jié)果表明，研究所用COⅠ基因序列在儲糧象甲種內(nèi)保守，種間變異較大，所測樣品種間遺傳距離平均值約為種內(nèi)遺傳距離平均值的56倍，滿足DNA條形碼有效性的建議標(biāo)準(zhǔn)，與Hebert等[3]研究理論一致，可以將此段序列作為分析及鑒別3種象甲的依據(jù)。

陳光輝等[24]在對玉米象的DNA條形碼研究中，通過基于K2P雙參數(shù)模型構(gòu)建的NJ樹，實(shí)現(xiàn)了將DNA條形碼用于玉米象的快速鑒別，本研究通過構(gòu)建COⅠ基因NJ系統(tǒng)樹，將玉米象、米象和谷象3種象甲聚為3個(gè)不同的小支，不同種類區(qū)別明顯，進(jìn)化樹聚類結(jié)果和形態(tài)分類結(jié)果一致，實(shí)現(xiàn)了將DNA條形碼用于米象、玉米象和谷象3個(gè)在形態(tài)上易混種的快速鑒別。

DNA條形碼方法對3種常見儲糧象甲的鑒定結(jié)果與經(jīng)典形態(tài)鑒別方法鑒定的結(jié)果完全一致，證明了DNA條形碼方法的有效性，與RFLP方法相比，根據(jù)Folmer等[18]COⅠ基因的DNA條形碼方法可以提供更多的定量和數(shù)據(jù)庫信息，方便更多的研究人員共享，而且，DNA條形碼方法比RFLP更準(zhǔn)確更穩(wěn)定[25]。對研究人員和從業(yè)人員而言，通過獲取簡單序列并進(jìn)行比對即可實(shí)現(xiàn)3種象甲的快速鑒別，便于檢驗(yàn)檢疫和害蟲防治方面的實(shí)際應(yīng)用[12]。Corrêa 等[26]利用從GenBank獲得的玉米象COⅠ基因序列(基因登錄號AY131100)和米象COⅠ基因序列(AY131099)設(shè)計(jì)種特異引物，對6個(gè)地理種群的48個(gè)個(gè)體進(jìn)行了鑒別，從本研究的結(jié)果看(表2、表3)，不同種類象甲的COⅠ基因存在不同的單倍型，某些位點(diǎn)存在變異，Corrêa 等[26]僅根據(jù)一種單倍型設(shè)計(jì)特異引物用于種的鑒別存在局限性。參照前人的研究方法[15,17,27]，在后續(xù)研究中，可利用本研究所得的3種儲糧象甲類害蟲的基因序列，結(jié)合GenBank獲取的序列，通過序列比對，針對不同種的特有堿基序列設(shè)計(jì)特異引物，可獲得適用性強(qiáng)的種特異引物。

本研究表明，基于COⅠ基因的DNA條形碼技術(shù)在象甲的分子鑒定上是有效的， DNA條形碼技術(shù)方便、快捷、經(jīng)濟(jì)且準(zhǔn)確，能解決儲糧害蟲形態(tài)鑒定存在的不足，在儲糧象甲分子鑒定上具有可行性，同時(shí)本研究為儲糧害蟲DNA條形碼技術(shù)的構(gòu)建提供了理論依據(jù)及實(shí)踐基礎(chǔ)。