崔順立 侯名語 胡曉輝 陳 靜 劉立峰*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué),河北 保定 071001；2.山東省花生研究所,山東 青島 266100)

毛狀根是植物受發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)誘導(dǎo)產(chǎn)生,最早于1907 年由Smith和Townsend發(fā)現(xiàn)。發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)毛狀根的生成主要依靠其體內(nèi)的Ri質(zhì)粒,該質(zhì)粒獨(dú)立于發(fā)根農(nóng)桿菌染色體之外,由DNA 轉(zhuǎn)移區(qū)(Transfer-DNA region,T-DNA)、毒性區(qū)(Virulence region,Vir)、復(fù)制起始區(qū)(Origin of replication,Ori)和冠癭堿代謝功能區(qū)(OPine CAtabolism,OPCA)組成。植物組織受到發(fā)根農(nóng)桿菌侵染時(shí),侵染部位的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生酚類小分子物質(zhì),誘導(dǎo)活化Ri質(zhì)粒的Vir區(qū),Vir區(qū)調(diào)控Ri質(zhì)粒的其他區(qū)完成侵染,產(chǎn)生毛狀根,并改變植物體內(nèi)代謝[1-2]。由于其生長(zhǎng)速度快、遺傳穩(wěn)定、次生物代謝含量高等特點(diǎn),在植物藥用成份生產(chǎn)、植物基因功能研究、植物根際研究中得到廣泛應(yīng)用。

花生是世界上廣泛種植的油料和經(jīng)濟(jì)作物,解析遺傳機(jī)制、研究花生基因功能是促進(jìn)花生產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)?；ㄉ仓曛泻胸S富的黃酮類多酚化合物[3-4],利用花生毛狀根生產(chǎn)白藜蘆醇等藥用成份已有探索性研究[5-6]。槲皮素是花生中主要的黃酮類功能成份[3-4],具有細(xì)胞保護(hù)作用的強(qiáng)效抗氧化性和抗纖維化作用,在150 mg·d-1劑量下可下調(diào)收縮壓。且在幾種腫瘤細(xì)胞系中表現(xiàn)出抗癌和凋亡誘導(dǎo)作用,如結(jié)腸癌CT-26 細(xì)胞、前列腺癌LNCaP細(xì)胞、人前列腺PC3細(xì)胞、嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞、雌激素受體陽性乳腺癌MCF-7細(xì)胞、急性淋巴細(xì)胞白血病MOLT-4 T 細(xì)胞、人骨髓瘤U266B1細(xì)胞、人淋巴結(jié)Raji細(xì)胞和卵巢癌CHO 細(xì)胞[7]。利用花生毛狀根生產(chǎn)槲皮素也將是解決槲皮素生產(chǎn)的重要方向。

因此,探索花生毛狀根生長(zhǎng)機(jī)理,對(duì)花生基因功能研究及藥用成份生產(chǎn)具有重要意義。已有研究多圍繞菌株種類、花生種質(zhì)、外植體類型及培養(yǎng)基成份等進(jìn)行探索,以提高發(fā)根轉(zhuǎn)化花生的效率[5,8-11],但相關(guān)機(jī)理研究鮮見報(bào)道。已有研究表明農(nóng)桿菌侵染植物時(shí),會(huì)產(chǎn)生乙酰丁香酮類多酚化合物,促進(jìn)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化(Escudero 和Hohn,1997)[12]。乙酰丁香酮在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中得到廣泛應(yīng)用?；ㄉ泻胸S富的黃酮類多酚化合物[3-4],但對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化所起的作用鮮有研究。本研究采用黃酮含量不同的花生種質(zhì)進(jìn)行發(fā)根轉(zhuǎn)化,測(cè)定發(fā)根農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率,以期為解析黃酮在發(fā)根農(nóng)桿菌侵染花生中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用10個(gè)花生種質(zhì)分別為:花育51號(hào)、花育36號(hào)、魯花11 號(hào)、灤平大花生、冀花16號(hào)、濮科花9號(hào)、冀農(nóng)花6號(hào)、P67-3、四粒紅、東北王。其中灤平大花生、冀花16號(hào)、冀農(nóng)花6號(hào)由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)花生研究室提供,其余7個(gè)由山東省花生研究所提供。均為2017年秋收獲的花生種子,干燥后貯存于-20℃冰箱。

發(fā)根農(nóng)桿菌菌株K599,由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院葛淑俊老師提供。

1.2 侵染及發(fā)根誘導(dǎo)

干燥花生種子依次經(jīng)75%乙醇浸泡1 min、無菌水清洗2次、0.1%氯化汞浸泡15 min、無菌水清洗3次后,接種在B5固體培養(yǎng)基上,于25℃、10 h光照/14 h黑暗下培養(yǎng)4 d。3次重復(fù),每重復(fù)50粒。培養(yǎng)4 d的花生子葉作為外植體,剝?nèi)シN皮,K599侵染15 min后接種于共培養(yǎng)基上,于黑暗條件下培養(yǎng)4 d后轉(zhuǎn)接到不含任何激素的發(fā)根培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d,統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)發(fā)根數(shù)并計(jì)算發(fā)根誘導(dǎo)率。

發(fā)根誘導(dǎo)率/%＝產(chǎn)生發(fā)根的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100

pH 5.4的共培養(yǎng)基成份為:3.2 g/L B5+20 g/L蔗糖+0.4 g/L MES+0.8 g/L 瓊脂+100 μmol/L乙酰丁香酮(AS)。pH 5.7發(fā)根培養(yǎng)基成份為:3.2 g/L B5+15 g/L蔗糖+0.4 g/L MES+0.8 g/L瓊脂+250 mg/L頭孢+100 mg/L特美汀(TIM)+100 mg/L萬古霉素。

篩選5株長(zhǎng)勢(shì)良好的根系切下,接種到發(fā)根培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d,將根取出37℃烘干2 d,稱質(zhì)量。

1.3 毛狀根GFP 基因PCR 驗(yàn)證

利用CTAB 法提取毛狀根中的DNA[4]。根據(jù)發(fā)根農(nóng)桿菌K599 T-DNA的基因序列(GenBank登記號(hào)EF433766),參考曹慶豐合成K599rolC基因擴(kuò)增引物P1(5'-3'):ATGGCGGAATTTGACCTAT和P2(5'-3'):TTAGTTCCATCTGCCCATCC,設(shè)定擴(kuò)增反應(yīng)體系及PCR程序[13]。

采用1%瓊脂糖凝膠電泳。引物在生工生物工程公司合成。Taq 酶購自寶生物工程公司,2 kb Marker購自博邁德生物公司,采用博邁德生物公司的5×DNA Loading Buffer with Gelred進(jìn)行染色。

1.4 黃酮含量測(cè)定

總黃酮含量測(cè)定參照Hou等[4]方法。以蘆丁(RT:Rutin)為標(biāo)準(zhǔn)品?？傸S酮含量(TFC,Total flavonoid content)以每克花生籽仁質(zhì)量(FM:Fresh Mass)含RT的μg當(dāng)量值表示,即:μg RTE/g FM。

1.5 結(jié)果計(jì)算

采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和繪圖,用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行種子黃酮含量差異顯著性檢驗(yàn)(LSD法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生種子黃酮含量

10個(gè)花生種質(zhì)中,以花育51號(hào)黃酮含量最高,為670μg RTE/g FM,其次是冀花16號(hào)和冀農(nóng)花6號(hào),均極顯著高于其他花生品種。含量最低的是四粒紅和濮科花9 號(hào),分別為408μg RTE/g FM,444μg RTE/g FM,顯著低于其他品種。

種子萌發(fā)后3～4 d,其黃酮含量的變化趨勢(shì)基本相同,均表現(xiàn)升高趨勢(shì),但至萌發(fā)后5 d時(shí),黃酮含量變化出現(xiàn)分異,其中,東北王、四粒紅、魯花11號(hào)、花育51號(hào)、冀農(nóng)花6號(hào)和濮科花9號(hào)等6個(gè)品種的總黃酮含量呈上升趨勢(shì),至第5 d升高幅度101.8～446.3μg RTE/g FM,以濮科花9號(hào)升幅最大；P67-3、花育36號(hào)、冀花16號(hào)和灤平大花生的黃酮含量在前4 d呈上升趨勢(shì),至第5 d時(shí)出現(xiàn)下降,以P67-3種質(zhì)降幅最大,為227.8μg RTE/g FM(圖1)。故選擇各種質(zhì)黃酮含量高的第4 d進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化。

圖1 花生種子及萌發(fā)過程中總黃酮含量Fig.1 TFC in peanut seeds during germination process

2.2 發(fā)根農(nóng)桿菌侵染花生種子結(jié)果

花生種子在B5培養(yǎng)基上萌發(fā)第4 d,胚根突破種皮0.2～0.5 cm 時(shí)進(jìn)行侵染與共培養(yǎng),發(fā)根培養(yǎng)基上第3 d開始長(zhǎng)出發(fā)根(圖2A、2B、2C)。根系培養(yǎng)5 d時(shí)進(jìn)行PCR驗(yàn)證,以未轉(zhuǎn)化的花生實(shí)生苗根作對(duì)照,含有rolC基因433 bp擴(kuò)增條帶視為轉(zhuǎn)化根系。圖3和圖4示出,花育51號(hào)誘導(dǎo)率最高,為71.0%,其次是東北王,為66.0%,誘導(dǎo)率最低是冀花16號(hào),僅為23.1%,濮科花9號(hào)誘導(dǎo)率30.4%,僅高于冀花16號(hào)。根系培養(yǎng)10 d后(圖2D),其干質(zhì)量以花育51號(hào)根最大,為0.047 g,最低為冀花16號(hào),其質(zhì)量?jī)H為0.013 g(圖4)。從整體趨勢(shì)分析發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)率高的種質(zhì)根質(zhì)量較高。

圖2 發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化花生種子過程Fig.2 Transformation process of peanut seeds by Agrobacterium rhizogenes

圖3 花生毛狀根中發(fā)根農(nóng)桿菌K599 rolC 基因PCR結(jié)果Fig.3 PCR amplification of rolC gene from Agrobacterium rhizogenes K599 in peanut hairy roots

圖4 發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化花生種子誘導(dǎo)率Fig.4 Induction rate of transformation of peanut seeds by Agrobacterium rhizogenes

2.3 發(fā)根農(nóng)桿菌侵染與花生種子黃酮含量關(guān)系

侵染時(shí)花生黃酮含量與發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)率之間相關(guān)分析表明兩者間呈線性負(fù)相關(guān)(圖5),相關(guān)系數(shù)r＝-0.78,即花生體內(nèi)的黃酮降低了發(fā)根誘導(dǎo)率。

圖5 發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)率與花生黃酮含量的相關(guān)關(guān)系Fig.5 Correlation between induction rate of Agrobacterium rhizogenes and TFC in peanut

3 討論

黃酮作為植物體內(nèi)抗氧化的次生代謝物質(zhì),在植物體抗病菌反應(yīng)中起著重要作用。根瘤菌侵入豆科作物根系的第一步即是刺激植物體分泌黃酮類物質(zhì),黃酮在根瘤菌膜上擴(kuò)散并誘導(dǎo)NodD(Nodulate D)蛋白質(zhì)的合成,從而激活其他與結(jié)瘤有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄[14]?？梢?黃酮可以起到抗病菌作用,但在豆科作物上又是有利于根瘤菌侵染的物質(zhì)。本研究結(jié)果顯示黃酮不利于發(fā)根農(nóng)桿菌侵染,而是起到了抗病作用。乙酰丁香酮類酚類化合物通過活化Vir區(qū),誘導(dǎo)發(fā)根產(chǎn)生,黃酮類多酚化合物是否抑制了Vir區(qū)活化,或在Vir區(qū)誘導(dǎo)其他區(qū)活化時(shí)起到阻礙作用從而抑制了發(fā)根產(chǎn)生,有待進(jìn)一步研究。另一方面,花生體內(nèi)含有多種黃酮類化合物,在抗發(fā)根農(nóng)桿菌侵染中起的作用可能不同。大豆發(fā)根抗鐮刀菌Fusariumsolanif.sp.glycines侵染時(shí),在大豆甙(daidzin)、黃豆甙(glycitin)、染料木甙(genistin)及三者各自的苷元前體、香豆雌酯(coumestrol)、大豆抗毒素(glyceollin)等8種異黃酮中,主要是大豆抗毒素起作用[15]。在進(jìn)一步研究中應(yīng)該明確花生中各黃酮在發(fā)根農(nóng)桿菌侵染中的作用。