韓宏偉 王傳堂 王志偉 孫東偉 杜祖波 李 秋 唐月異王菲菲焦 坤

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,遼寧 沈陽 110866；2.山東省花生研究所,山東 青島 266100；3.山東魯花集團(tuán)有限公司,山東 萊陽 265200)

花生是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物,據(jù)統(tǒng)計,2019年全國播種面積463萬hm2,總產(chǎn)量1752萬t,單產(chǎn)3781 kg/hm2[1]。花生籽仁富含脂肪、蛋白質(zhì)、糖類、礦物質(zhì)及多種維生素等,對促進(jìn)人體新陳代謝和改善記憶力等都有所裨益,是一種集益智、抗衰、延壽等功效于一體的農(nóng)產(chǎn)品[2]。

油酸和亞油酸是花生兩種主要脂肪酸,兩者之和約占脂肪酸總量的80%,呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系,兩者含量和比例是衡量花生和花生油品質(zhì)的重要指標(biāo)[3-5]。普通花生油酸含量一般為40%～60%,而高油酸花生油酸含量高于70%[6]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),FAD2A和FAD2B即ol1和ol2兩對隱性基因是控制花生高油酸性狀的主效基因[3,7-9]。

雜交育種是培育高油酸花生品種的有效途徑,但高油酸供體嚴(yán)重匱乏且多為F435型FAD2突變,花生高油酸育種狹窄的遺傳基礎(chǔ)亟待拓寬。據(jù)2016年底統(tǒng)計,我國38個高油酸花生品種高油酸供體為F435、SPI098、0002-2、CTWE和P76等5份材料(全部為F435型FAD2突變),國外高油酸供體主要有F435、458、FR596、GA-T2636M、AT 225 High oleic等材料,國內(nèi)外可追溯高油酸供體的花生品種78%以上具有F435型FAD2突變[10]。

CAPS法、PCR產(chǎn)物直接測序法、Taq Man探針法、AS-PCR 法、KASP法等各種分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于花生FAD2基因型分析已有報道[11-14]。其中AS-PCR 法因其操作相對簡單、對儀器設(shè)備要求不高而應(yīng)用較廣。

本團(tuán)隊(duì)前期篩選獲得了高油酸花生化學(xué)突變體15L46HO,FAD2A/FAD2B基 因PCR 產(chǎn) 物直接測序結(jié)果表明,其FAD2A突變?yōu)镕435 型(FAD2AG448A),FAD2B突變?yōu)樾峦蛔?。本研究在此基礎(chǔ)上對FAD2B基因進(jìn)行克隆測序,并建立檢測新突變位點(diǎn)的AS-PCR 技術(shù),以期為雜種鑒定及高油酸花生標(biāo)記輔助選擇育種提供便捷的工具。

1 材料和方法

1.1 供試材料

野生型花生15L46(20MNCK-1)為本團(tuán)隊(duì)育成的普通油酸高產(chǎn)品系(油酸含量42.4%,亞油酸含量35.7%),突變型花生15L46HO(20 MNHO-15)為本團(tuán)隊(duì)利用15 mmol/L疊氮化鈉處理15L46預(yù)浸種子獲得的高油酸突變體,其油酸含量79.7%、亞油酸含量4.35%。

1.2 DNA 提取

采用本團(tuán)隊(duì)建立的方法(專利號:ZL 2009 1 0255786.0)快速提取花生子葉DNA。該方法不需液氮研磨,用時短,費(fèi)用低,且不影響種子發(fā)芽。

1.3 FAD 2B 基因克隆測序

采用PCR 引物對bF19/R1擴(kuò)增突變體和野生型花生FAD2B基因[11]。完成后,電泳檢測PCR產(chǎn)物質(zhì)量和濃度,對產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。使用擎科pClone007 Versatile Simple Vector Kit將純化的擴(kuò)增片段與載體連接,并轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌擎科TreliefTM5αChemically Competent Cell,菌落PCR法(2×T5 Super PCR Mix,Colony)鑒定陽性克隆,送北京擎科生物科技測序。

1.4 AS-PCR 引物設(shè)計及擴(kuò)增程序

針對FAD2B基因558 bp處突變設(shè)計2組特異性引物(表1),擴(kuò)增野生型和突變型FAD2B。其中FAD2B-F2 為上游通用引物、FAD2B-A3 和FAD2B-A4為突變位點(diǎn)特異性引物、FAD2B-R2為下游通用引物。引物由北京擎科生物科技合成。

表1 針對FAD 2B 突變位點(diǎn)G558A設(shè)計的AS-PCR 引物組合Table 1 AS-PCR primer combinations based on the FAD 2B mutated site G558A

針對上述引物,參考Yu等[15]方法建立AS-PCR反應(yīng)混合體系和PCR反應(yīng)程序。25μL反應(yīng)體系:2×TaqPCR Mix(北京天根生化科技)12.5μL、模板DNA1.5μL、特異性引物1μL、上游引物1μL、下游引物0.25μL、無菌雙蒸水8.75μL。PCR程序:94℃1 min,94℃30 s,53℃30 s,72℃30 s,30個循環(huán)；72℃5 min。在東勝龍EDC-810型PCR儀上完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 FAD 2B 基因編碼序列比較

用引物對bf19/R1擴(kuò)增FAD2B目的基因,得到1255 bp擴(kuò)增產(chǎn)物,長度符合預(yù)期。經(jīng)序列比對,發(fā)現(xiàn)高油酸突變體FAD2B基因具有G558A 突變(圖1),與之前PCR 產(chǎn)物直接測序結(jié)果一致。全部突變型克隆均具有該突變位點(diǎn)。FAD2BG558A 突變位點(diǎn)導(dǎo)致提前產(chǎn)生一終止密碼子,從而影響了該基因的功能。

圖1 FAD 2B 基因部分序列比較,紅框示突變位點(diǎn)Fig.1 Partial FAD 2B DNA sequences,red-block showing mutated site FAD 2B G558A

2.2 FAD 2B G558A突變位點(diǎn)AS-PCR檢測

圖2可看出,產(chǎn)物條帶清晰,其中由上游引物與特異性引物擴(kuò)增出的目的條帶約為150 bp；由上游引物和下游引物擴(kuò)增出的內(nèi)參條帶約為350 bp,該條帶是反應(yīng)成功的標(biāo)志。無論是第一組引物還是第二組引物,突變型DNA 能同時擴(kuò)增出目的條帶和內(nèi)參條帶,證明該突變堿基存在；而野生型DNA只能擴(kuò)增出內(nèi)參條帶,無目的條帶,證明其不含突變堿基。兩組引物擴(kuò)增效果穩(wěn)定。

圖2 兩組AS-PCR 特異引物(1、2)鑒定FAD 2B G558A 突變Fig.2 Identification of FAD 2B G558A mutation using two sets of AS-PCR specific primers(set 1 and set 2)

3 結(jié)論與討論

自1995年在美國鑒定出全球首個高油酸花生自然突變體F435之后,采用F435做直接親本或間接親本培育出很多品種[10]。隨后陸續(xù)有誘發(fā)高油酸突變體或鑒定自然突變體的報道,但多具F435型FAD2突變,圍繞該突變類型建立了包括AS-PCR法在內(nèi)的多種FAD2基因型分析方法,提高了選擇效率[10]。

AS-PCR法原理是利用Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增時,引物3’端最后一個堿基與目標(biāo)片段的堿基錯配使反應(yīng)受阻無法擴(kuò)增,而與SNP堿基互補(bǔ)的特異性引物有擴(kuò)增產(chǎn)物,從而將野生型與突變型辨別出來[16]。本研究所采用的高油酸化學(xué)突變體具有不同于以往報道的FAD2B新突變G558A。本研究基于AS-PCR法原理,設(shè)計出兩組AS-PCR引物,均能很好地鑒別FAD2B是否存在G558A新突變,但要確定該突變位點(diǎn)是否純合,仍需另外設(shè)計針對野生型的引物。

總之,本研究通過對FAD2B基因進(jìn)行克隆測序,成功設(shè)計出兩組AS-PCR 引物,實(shí)現(xiàn)了對FAD2BG558A突變型基因的分子檢測。該方法操作簡單,成本低,結(jié)果穩(wěn)定,作為標(biāo)記輔助選擇工具,將促進(jìn)該高油酸新型突變體的育種利用。