潘麗娟 王 冕 蘇茂文 陳明娜 王 通 許 靜 楊 珍孫 偉鄒宗峰禹山林陳 娜*遲曉元*

(1.山東省花生研究所,山東 青島 266100；2.青島海關(guān),山東 青島 266001；3.臨沂市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,山東 臨沂 276012；4.煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,山東 煙臺(tái) 264001)

LEC1(LEAFYCOTYLEDON1) 是編碼CCAAT-box結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子HAP3(Heme-activated protein 3)亞單位的基因,在植物種子胚發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用,而且是種子成熟、儲(chǔ)藏物質(zhì)積累的重要調(diào)控因子[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),LEC1在擬南芥葉片中異位表達(dá)能誘導(dǎo)胚特異基因在葉中的表達(dá)[3]。擬南芥lec1突變體出現(xiàn)胚胎發(fā)育異常且不耐干燥[4]、部分種子成熟特異基因的表達(dá)受到抑制和種子貯藏蛋白的表達(dá)量降低等現(xiàn)象[5-6]。同時(shí),LEC1影響植物脂肪酸生物合成基因的表達(dá),對(duì)脂肪酸生物合成進(jìn)行調(diào)控[7]。研究表明,在擬南芥中過表達(dá)擬南芥或甘藍(lán)型油菜LEC1 基因,可促進(jìn)脂肪酸代謝途徑上多個(gè)基因表達(dá)量的增加,從而提高植物組織中脂肪酸的含量[8]。Elahi等研究發(fā)現(xiàn),在油菜中過量表達(dá)LEC1 基因,使得種子油脂含量增加7%～16%,LEC1能促進(jìn)在種子發(fā)育過程中與脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá)[9]。在玉米中過量表達(dá)ZmLEC1基因時(shí),提高了其種子的油脂含量[10]。這些試驗(yàn)結(jié)果表明LEC1是植物脂肪酸合成過程中的正調(diào)控因子。因此,對(duì)LEC1 基因的發(fā)掘,為油料作物種子品質(zhì)改良研究提供了新的思路。

本研究前期從花生中分離克隆了2個(gè)AhLEC1基因(AhLEC1A,GenBank登錄號(hào)KP 090434；AhLEC1B,GenBank登錄號(hào)KP090435),在此基礎(chǔ)上進(jìn)行原核表達(dá)分析,并初步分析了AhLEC1基因在花生生長(zhǎng)發(fā)育過程中的表達(dá)以及對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答情況,為深入研究AhLEC1基因在花生中的生物學(xué)功能提供參考信息,也為利用基因工程手段改良花生品質(zhì)提供新的候選基因。

1 材料與方法

1.1 植物材料

組織表達(dá)分析選用不同含油量的花生品種花育17號(hào)(粗脂肪含量44.6%)、白沙1016(粗脂肪含量56.0%)和徐花9號(hào)(粗脂肪含量60.9%)。參照潘麗娟等[11]的方法進(jìn)行花生組織取樣,略有修改?；ㄉ⒒ㄆ诓杉?花生開花下針后采集果針和花后15、25、35、45、55、65和75 d的莢果以及花后35、45、55、65和75 d的種子,樣品經(jīng)液氮速凍后立即放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

非生物脅迫表達(dá)分析所用花生材料為花育33號(hào),參照潘麗娟等[12]的方法進(jìn)行品種前處理?；ㄉL(zhǎng)至三葉期后進(jìn)行非生物脅迫處理試驗(yàn)。低溫處理是將生長(zhǎng)于土中的花生幼苗置于光照培養(yǎng)箱中,溫度設(shè)定為4℃。用NaCl和PEG6000進(jìn)行處理時(shí),將花生幼苗從土中小心拔出,用清水沖洗根部后直接浸泡于200 mmol/L NaCl或20%PEG6000溶液中。所有處理均在處理的0、4、8、12、24和72 h分別取葉片,液氮冷凍保存,作為后續(xù)試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)試劑

總RNA 提取試劑盒和E.coliBL21感受態(tài)購(gòu)自天根生化科技有限公司,M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega,載體p ET-28b購(gòu)自Novagen,T4 DNA 連接酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司,凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司,Super GelRed購(gòu)自US Everbright Inc,熒光定量PCR 用SYBR Green PreMix試劑盒購(gòu)自MDBio臺(tái)灣生工。

1.3 原核表達(dá)分析

根據(jù)AhLEC1基因的CDS序列和原核表達(dá)載體pET-28b,設(shè)計(jì)特異性引物,5'端引物加了EcoRI酶切位點(diǎn):5'-GAATTCATGGAAACTGGAGGAGGCTTT-3',3'端引物加了XhoI酶切位點(diǎn):5'-CTCGAGTCATTTGTATTGAGTATTTGG-3'。進(jìn)行基因擴(kuò)增,分別構(gòu)建p ET-28b-AhLEC1A和p ET-28b-AhLEC1B原核表達(dá)載體。將p ET-28b-AhLEC1A和p ET-28b-AhLEC1B原核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化至E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞中,進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)及SDS-PAGE 分析。具體流程參照潘麗娟等[12]的方法進(jìn)行。含重組質(zhì)粒的菌液培養(yǎng)至OD600約為0.6 時(shí),加入0.5 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。分別于誘導(dǎo)后0、2、6、10、16 h收集菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳,分析蛋白表達(dá)結(jié)果。

1.4 qRT-PCR 分析

qRT-PCR反應(yīng)的方法和條件參照陳娜等[13-14],內(nèi)參基因?yàn)锳ctin11,每樣品重復(fù)3次,采用2-ΔΔCt法[15]分析數(shù)據(jù)。qRT-PCR分析所用引物如下:Actin11引物為5'-TTGGAATGGGTCAGAAGGATGC-3'和5'-AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3'；AhLEC1引物為5'-CTTTCCTACCACTACCTCTG-3'和5'-ATCTTGCTCCCTCACAGTG-3'。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ah LEC 1蛋白的原核表達(dá)

將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒p ET-28b-AhLEC1A和p ET-28b-AhLEC1B分別轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株BL21 中,用0.5 mmol/L 的IPTG 誘 導(dǎo) 表達(dá),于誘導(dǎo)后0、2、6、10、16 h分別收集菌液,菌液分上清和沉淀兩部分單獨(dú)收集,進(jìn)行SDS-PAGE電泳 檢 測(cè)。由 于AhLEC1A和AhLEC1B的CDS序列僅有27個(gè)堿基差異,因此兩者目的蛋白的預(yù)測(cè)值差異不大,AhLEC1A 蛋白預(yù)測(cè)值為25.4 k D,AhLEC1B 蛋白預(yù)測(cè)值為25.3 k D。SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果表明,在分子量25 k D和35 kD之間出現(xiàn)明顯的特異性目的條帶(圖1),分別與Ah LEC1A 和Ah LEC1B的蛋白分子量預(yù)測(cè)值一致。

2.2 Ah LEC 1基因在花生發(fā)育過程中的表達(dá)

由圖2 可知,分別在3 個(gè)花生品種中檢測(cè)AhLEC1基因在花生莢果發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。AhLEC1基因在花育17號(hào)的花和果針中表達(dá)量低,隨著莢果發(fā)育,AhLEC1 基因表達(dá)量逐漸升高,在莢果發(fā)育的第4個(gè)時(shí)期AhLEC1基因表達(dá)量達(dá)到峰值,隨后又出現(xiàn)降低。AhLEC1基因在白沙1016和徐花9號(hào)的花和果針中也是微量表達(dá),隨著莢果發(fā)育,AhLEC1 基因表達(dá)量逐漸升高,分別在莢果發(fā)育的第5個(gè)時(shí)期和第6個(gè)時(shí)期達(dá)到峰值,隨后逐漸降低。AhLEC1基因在3個(gè)花生品種的莢果發(fā)育過程中都出現(xiàn)先增后降的趨勢(shì),但基因的表達(dá)量在花生不同品種間存在差異,其表達(dá)峰值出現(xiàn)的時(shí)期也有所不同,這種表達(dá)差異可能由品種間差異引起。

圖2 Ah LEC 1基因在花生不同組織及種子不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析Fig.2 Analysis on expression of AhLEC 1 in different tissues and seed development stages of peanut

AhLEC1基因在3 個(gè)花生品種種子發(fā)育過程中的表達(dá)模式略有不同,其基因表達(dá)峰值都出現(xiàn)在種子發(fā)育的第一個(gè)時(shí)期(花后35 d),發(fā)育的后期(花后45、55、65、75 d)出現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。上述結(jié)果表明,AhLEC1基因參與了花生莢果和種子的發(fā)育過程,可能是種胚形成、種子成熟、儲(chǔ)藏物質(zhì)積累的調(diào)控因子。

2.3 AhLEC1基因在非生物脅迫條件下的表達(dá)分析

圖3可看出,以0 h花生三葉期幼苗為對(duì)照,在4℃、NaCl和PEG6000 處理的花生葉片中AhLEC1基因均明顯誘導(dǎo)表達(dá)。AhLEC1 基因在低溫處理4h后表達(dá)量上調(diào),8 h后表達(dá)量約為對(duì)照的18倍,隨后表達(dá)量有所下降,但在24 h后表達(dá)量又達(dá)到最高,最高上調(diào)倍數(shù)約22倍。NaCl處理4h時(shí)AhLEC1基因表達(dá)無(wú)明顯變化,12 h后表達(dá)量最高,最高上調(diào)倍數(shù)約23倍,隨后表達(dá)量明顯下降。AhLEC1基因在PEG6000處理后表達(dá)量明顯上調(diào),4 h后表達(dá)量最高,為對(duì)照的12倍左右,之后表達(dá)量大幅下降。熒光定量PCR 結(jié)果表明,AhLEC1基因在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)低溫、高鹽及干旱三種非生物脅迫均有響應(yīng),說(shuō)明該基因在花生對(duì)抗逆境脅迫中可能發(fā)揮了一定作用。

圖3 Ah LEC 1基因在非生物脅迫條件下的表達(dá)量分析Fig.3 Analysis on expression of Ah LEC 1 under abiotic stress

3 討論與結(jié)論

LEC1是真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子CBF 亞基HAP3的同源基因[16],HAP3基因可分為L(zhǎng)EC1類型和非LEC1類型兩大類。在種子植物進(jìn)化的早期,LEC1型基因參與到一個(gè)新的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,參與胚的形成以及種子發(fā)育后期物質(zhì)積累等過程[17-18]。本研究組織特異性表達(dá)分析顯示,AhLEC1基因在花生的花、果針、莢果及種子中均有不同水平的表達(dá)量。其中在花和果針中表達(dá)量低,在莢果和種子發(fā)育過程中分別出現(xiàn)了明顯的時(shí)序表達(dá)特性。AhLEC1 基因在參試的3個(gè)花生品種種子發(fā)育的第一個(gè)時(shí)期(花后35 d)表達(dá)量最高,發(fā)育的后期(花后45、55、65、75 d)出現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。花生莢果在花后30～60 d是快速增長(zhǎng)階段,60 d后增長(zhǎng)緩慢；籽仁發(fā)育相對(duì)滯后,花后40～70 d是快速增長(zhǎng)階段[19]。因此,AhLEC1基因在花后35 d有較高的表達(dá),說(shuō)明其可能參與了花生種胚形成早期的調(diào)控。

研究表明,LEC1可能參與植物對(duì)非生物脅迫反應(yīng)的逆境信號(hào)通路。大麥根中HvLEC1基因受到鹽脅迫后快速上調(diào)表達(dá),且在后續(xù)時(shí)間保持高表達(dá)水平,顯示HvLEC1可能在大麥對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)中起作用[20]。劉豪等[21]研究結(jié)果表明,小麥TaLEC1基因參與ABA 依賴的脅迫響應(yīng),可能在小麥耐受高溫脅迫和滲透脅迫過程中發(fā)揮著重要的脫水保護(hù)功能。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)AhLEC1 基因在低溫、高鹽及干旱脅迫下的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),AhLEC1基因?qū)θN非生物脅迫均有明顯響應(yīng),說(shuō)明該基因在花生應(yīng)對(duì)逆境脅迫的反應(yīng)中可能發(fā)揮了一定的作用。

此外,前人報(bào)道,過表達(dá)LEC1基因能促進(jìn)脂肪酸代謝途徑上的多個(gè)基因表達(dá)變化,從而影響植物脂肪酸合成,提高植物組織中脂肪酸含量,是植物脂肪酸代謝的重要調(diào)控因子[7,22]。因此,對(duì)AhLEC1基因的研究可進(jìn)一步解析花生脂肪酸合成代謝途徑的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),為花生種子品質(zhì)改良提供研究新思路。目前對(duì)LEC1表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究還十分有限,LEC1與參與油脂合成途徑的其他調(diào)控因子的作用方式也有待研究[23],花生中對(duì)LEC1表達(dá)調(diào)控的研究更是鮮有報(bào)道。因此,本研究在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上,對(duì)花生AhLEC1基因進(jìn)行了原核表達(dá)分析,獲得了與理論分子量一致的目標(biāo)蛋白；并對(duì)該基因在花生發(fā)育過程中的表達(dá)特性以及其對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)進(jìn)行分析,為后期深入了解AhLEC1的生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制奠定重要基礎(chǔ)。