彭琳，劉幸紅，劉丙花，齊英杰，亓玉昆，馬海林，劉方春，牟相芹，付剛鋒

（1.山東省林業(yè)科學(xué)研究院，山東 濟(jì)南 250014；2.金正大生態(tài)工程集團(tuán)股份有限公司，山東 臨沂 276700；3.山東省林業(yè)科技培訓(xùn)中心，山東 濟(jì)南 250013；4.山東新超農(nóng)業(yè)科技有限公司，山東 聊城 252000）

植樹(shù)造林是改良鹽堿地的生物措施之一，不但可以改善環(huán)境，抑制土壤鹽堿化［1］，而且可以直接利用鹽堿地生產(chǎn)林木，提高鹽堿地的生產(chǎn)能力和經(jīng)濟(jì)效益［2］。但是，鹽堿地人工林普遍存在著生產(chǎn)力低下、大面積衰退現(xiàn)象，導(dǎo)致林業(yè)生態(tài)服務(wù)功能弱化［3］。大量研究表明：深層土壤鹽分含量高、林地土壤肥力差是造成鹽堿地人工林退化的主要原因［4］。

利用微生物改良鹽堿土成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)［5］。研究表明：鹽生植物根際促生細(xì)菌能夠改善土壤微生物區(qū)系，提高微生物活性，降低土壤鹽堿度，提高養(yǎng)分利用率，促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)的合成，增加土壤速效養(yǎng)分，調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)，增強(qiáng)植物耐鹽堿能力，鹽生植物根際促生細(xì)菌在低肥力的鹽堿地中表現(xiàn)出重大的應(yīng)用潛力［6－8］。

本研究從白蠟（Fraxinus chinensis）根際土壤中［9］篩選獲得一株耐鹽堿效果突出的菌株TIA062，并對(duì)其進(jìn)行了鑒定。為了進(jìn)一步降低其發(fā)酵成本、提高應(yīng)用價(jià)值，對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基成分與發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為后期推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 土壤樣品及處理 在山東省東營(yíng)市黃河三角洲白蠟種植園內(nèi)，利用采樣器在土壤表層5 cm處用多點(diǎn)混樣法［10］采集白蠟根際土樣10個(gè)，放入無(wú)菌自封袋中密封。所有樣品做好標(biāo)簽并于4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 化學(xué)試劑 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g／L，酵母粉55.0 g／L，NaCl 10.0 g／L，瓊脂粉20.0 g／L，pH值為7.0～7.2。121℃滅菌20 min。

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g／L，酵母粉5.0 g／L，NaCl 10.0 g／L，pH 值為7.0～7.2。121℃滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g／L，NaCl 50.0 g／L，牛肉膏3.0 g／L，瓊脂20.0 g／L，pH＝7.4。121℃滅菌20 min。

1.1.4 儀器與設(shè)備 TU－1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LRHS－250F－Ⅱ型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；BCL－1360B型超凈工作臺(tái)，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；THZ－C－1型恒溫振蕩器，常州市國(guó)旺儀器制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株篩選 通過(guò)三區(qū)劃線法、小麥葉片保綠法和蘿卜子葉增重法［11］，結(jié)合細(xì)菌形態(tài)和生理生化特征測(cè)定［12］，從白蠟根際土壤樣品中篩選獲得一株耐鹽堿效果突出的菌株，編號(hào)TIA062，接于LB斜面上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株鑒定 使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取TIA062菌株的總DNA，由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將16S rDNA基因序列上傳至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)獲得登錄號(hào)，并將其序列于NCBI中進(jìn)行比對(duì)，使用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析［13］。

1.2.3 種子液制備及生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將TIA062接于LB固體平板培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，37℃條件下培養(yǎng)18 h。于活化平皿中挑取一環(huán)接種至裝液量為50 mL（250 mL三角瓶）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r／min搖床振蕩培養(yǎng)20 h，備用。

生長(zhǎng)曲線的測(cè)定［13］：取活化后TIA062一環(huán)接種至裝液量為30 mL（250 mL三角瓶）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r／min搖床振蕩培養(yǎng)，每2 h取一次樣，測(cè)定發(fā)酵液在波長(zhǎng)600 nm條件下的OD值，并繪制菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 培養(yǎng)基成分優(yōu)化 （1）單因素試驗(yàn)：菌株培養(yǎng)的基礎(chǔ)條件為：以1%的接種量將種子液接種至LB液體培養(yǎng)基中，裝液量40%（V／V），置于37℃、180 r／min搖床上培養(yǎng)20 h，每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù)。固定其他元素不變，分別用不同碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽。替換碳源及添加量為：3%的玉米淀粉、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖；替換氮源及添加量為：2%的酵母膏、蛋白胨、豆粕、硝酸鈉；替換無(wú)機(jī)鹽及添加量為：0.3%的KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCO3。

（2）正交試驗(yàn)優(yōu)化：利用單因素試驗(yàn)找出最佳碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽后，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，進(jìn)一步確定最佳配比［14］。正交試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化 （1）pH試驗(yàn)：分別選取6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5作為培養(yǎng)基初始值，按5%接種量將菌液接種到已調(diào)pH的100 mL培養(yǎng)基中，37℃、180 r／min搖床培養(yǎng)18 h后測(cè)定OD600值。

（2）轉(zhuǎn)速試驗(yàn)：分別選取90、120、150、180、210 r／min作為搖床轉(zhuǎn)速，按（1）結(jié)果調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始值，將菌液接種到種子培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)18 h后測(cè)定OD600值。

（3）溫度試驗(yàn)：選取28、32、37、41、45℃作為搖床溫度，按（1）、（2）結(jié)果調(diào)節(jié)發(fā)酵液初始pH值和轉(zhuǎn)速，將菌液接種到種子培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)18 h后測(cè)定OD600值。

（4）接種量試驗(yàn)：選擇1%、2%、3%、4%、5%共5個(gè)接種量梯度，按（1）、（2）、（3）結(jié)果調(diào)整初始pH 值、轉(zhuǎn)速和溫度，搖床培養(yǎng)18 h后測(cè)定OD600值。

（5）裝瓶量試驗(yàn)：選擇50、75、100、125、150 mL（250 mL三角瓶）裝液量梯度，按（1）、（2）、（3）、（4）結(jié)果調(diào)整初始pH值、轉(zhuǎn)速、溫度和接種量，搖床培養(yǎng)18 h后測(cè)定OD600值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

由圖1可知，TIA062菌落圓形規(guī)則，較小，表面凸起較濕潤(rùn)，呈微黃色，不透明。菌體較小，短桿狀，無(wú)芽孢。其生理生化特性見(jiàn)表2。

圖1 TIA062菌落和菌體形態(tài)

表2 TIA062生理生化特性

2.2 菌株的鑒定

TIA062菌株16S rDNA與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)序列比對(duì)結(jié)果顯示，其與Enterobacter cloacae同源性達(dá)98.97%；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）表明，TIA062與Enterobacter cloacae處于同一分枝，結(jié)合菌落形態(tài)和生理生化特征將其鑒定為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）。

圖2 TIA062基于16SrDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 菌株生長(zhǎng)曲線

由圖3可知，0～2 h為延遲期；從第4 h開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體生長(zhǎng)迅速，濃度快速升高；18～24 h生長(zhǎng)速度逐漸減小至平緩。因此，選擇培養(yǎng)16～18 h的菌體作為種子液。

圖3 陰溝腸桿菌TIA062的生長(zhǎng)曲線

2.4 培養(yǎng)基成分優(yōu)化

所選4種碳源的發(fā)酵菌液涂布后結(jié)果（表3）顯示，以玉米淀粉為碳源的發(fā)酵菌液中菌落數(shù)量最多；其次是蔗糖、葡萄糖；可溶性淀粉效果較差，因此選用玉米淀粉作為碳源。所選4種氮源的發(fā)酵菌液涂布后結(jié)果（表4）顯示，以蛋白胨為氮源的發(fā)酵菌液菌落數(shù)量最多；其次為酵母膏；硝酸鈉、豆粕較差，因此選用蛋白胨作為氮源。所選4種無(wú)機(jī)鹽的發(fā)酵菌液涂布結(jié)果（表5）顯示，Ca-CO3為最佳無(wú)機(jī)鹽選擇。

表3 碳源優(yōu)化

表4 氮源優(yōu)化

表5 無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化

2.5 正交試驗(yàn)分析

以玉米淀粉（A）、蛋白胨（B）、CaCO3（C）為因素，按L9（33）正交表設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn)，以菌落總數(shù)作為指標(biāo)，確定培養(yǎng)基中各組分的最佳用量［15］。結(jié)果（表6）表明，最佳水平組合為A1B2C2。方差分析結(jié)果表明，因素B 對(duì)TIA062生長(zhǎng)的影響顯著。因此，確定培養(yǎng)基配方為玉米淀粉1%、蛋白胨1.5%、CaCO30.3%。

表6 正交試驗(yàn)分析

2.6 發(fā)酵條件優(yōu)化

在確定培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果（圖4）表明，一定范圍內(nèi)單位體積發(fā)酵液的OD600值隨著裝瓶量的增大、培養(yǎng)溫度的上升、轉(zhuǎn)速的加快、接種量的增多而增加。pH過(guò)高或者過(guò)低，都會(huì)抑制菌的正常生長(zhǎng)；轉(zhuǎn)速太慢，溶氧量不足，轉(zhuǎn)速太快會(huì)造成細(xì)胞破裂；接種量太大，細(xì)菌衰退期提前，接種量太少，延遲期時(shí)間增加。綜上所述，培養(yǎng)基pH＝7.0、裝瓶量100 mL（250 mL三角瓶）、培養(yǎng)溫度37℃、轉(zhuǎn)速180 r／min、種子液接種量3%為TIA062菌株最佳發(fā)酵條件，在此條件下，TIA062的菌落數(shù)為1.325×1011cfu／mL。

圖4 不同培養(yǎng)條件對(duì)TIA062生長(zhǎng)的影響

3 討論與結(jié)論

生長(zhǎng)培養(yǎng)基不僅為菌株提供生長(zhǎng)和繁殖所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，更是其合成代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)，因此培養(yǎng)基的組分對(duì)菌株生長(zhǎng)及活性物質(zhì)的產(chǎn)生至關(guān)重要［16］。篩選出最佳碳源、氮源、碳氮比，及適宜的發(fā)酵條件（如pH、溫度、培養(yǎng)時(shí)間、通氣量和接種量等）是發(fā)酵的重要環(huán)節(jié)［17］，這些因素相互促進(jìn)與制約。因此，需要對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件和發(fā)酵條件的各種因子進(jìn)行優(yōu)化分析。培養(yǎng)條件的優(yōu)化通常采用正交試驗(yàn)或響應(yīng)曲面法［18］，大多應(yīng)用于微生物酶活性的提高、分泌抗生素或抗菌蛋白等有益產(chǎn)物等方面［19，20］，而在根際促生菌的培養(yǎng)條件優(yōu)化方面研究較少。

本研究的單因子試驗(yàn)結(jié)果顯示，玉米淀粉作為碳源、蛋白胨作為有機(jī)氮源、CaCO3作為無(wú)機(jī)鹽最有利于TIA062的生長(zhǎng)。優(yōu)化發(fā)酵條件試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株最適發(fā)酵條件為pH＝7.0、溫度為37℃、250 mL三角瓶裝液量100 mL、3%接菌量、轉(zhuǎn)速為180 r／min。本試驗(yàn)為該菌株的進(jìn)一步推廣應(yīng)用及促生機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。