苗衛(wèi)東，井朋偉，王萌，張新宇，周瑞金

（河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

克瑞森無核葡萄（Crimson seedlessVitis viniferaL.）又名緋紅無核、淑女無核，屬歐亞種葡萄，是美國加利福尼亞州戴維斯農(nóng)學(xué)院將皇帝與C33－199進(jìn)行雜交而獲得的晚熟無核葡萄品種［1］。克瑞森無核葡萄具有色澤艷麗、粒大肉脆、耐儲性強等特點，深受人們喜愛［2］。采用離體培養(yǎng)技術(shù)可以獲得克瑞森無核葡萄無菌苗，而影響成苗的關(guān)鍵是外植體、培養(yǎng)基及激素的選用。不同的外植體離體培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基和激素不同［3－11］。郎鳳紅［3］、張美玲［4］、陶建敏［5］、Clog［6］等分別以葡萄葉柄、單芽莖段和葉片等為外植體通過器官發(fā)生獲得植株；Zhu［7］、Reustle［8］、Salunkhe［9］等利用葡萄葉片、莖段等外植體及原生質(zhì)體獲得了完整植株。

本試驗分別以克瑞森無核葡萄的帶芽莖段、葉片和卷須為外植體，通過離體培養(yǎng)，確定了0.1%升汞浸泡帶芽莖段外植體的消毒時間，篩選了適合葉片外植體的抗褐變劑以及分別適宜帶芽莖段外植體離體培養(yǎng)側(cè)芽和不定根、葉片和卷須外植體誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基，以期為克瑞森無核葡萄不同器官離體培養(yǎng)獲得無菌苗提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試葡萄品種為克瑞森無核葡萄，選用一年生枝條的帶芽莖段、葉片、卷須作為外植體。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 0.1%升汞消毒時間試驗 先將葡萄帶芽莖段浸泡在75%酒精中消毒1 min，再用0.1%升汞溶液分別消毒3、4、5、6、7、8 min，然后接種到B5＋30 g／L蔗糖＋7 g／L瓊脂＋1.0 mg／L 6－BA＋0.5 mg／L IBA（pH 6.0）上，在（25±1）℃、光照強度1 500～2 000 lx、16 h光照／8 h黑暗條件下培養(yǎng)7 d，觀察外植體污染情況，統(tǒng)計外植體污染數(shù)、褐變數(shù)和成活數(shù)，計算污染率、褐變率及成活率。污染率（%）＝污染外植體數(shù)／接種總數(shù)×100；褐變率（%）＝褐變外植體數(shù)／接種總數(shù)×100；存活率（%）＝存活外植體數(shù)／接種總數(shù)×100。

1.2.2 不同抗褐變劑篩選試驗 在培養(yǎng)基B5＋30 g／L蔗糖＋7 g／L瓊脂＋0.5 mg／L 6－BA＋1.0 mg／L 2，4－D（pH 6.0）中分別加入1.5 g／L活性炭（AC）、2.0 g／L吡咯烷酮（PVP）、0.006 g／L維生素C（VC），將葉片外植體分別接種在這3種培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件同上，40 d后觀察其褐變程度。誘導(dǎo)率（%）＝愈傷組織數(shù)／接種后未污染的外植體數(shù)×100；褐變率（%）＝褐變愈傷組織數(shù)／接種總數(shù)×100。

1.2.3 以帶芽莖段為外植體的側(cè)芽和不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選 以B5＋30 g／L蔗糖＋7 g／L瓊脂為基本培養(yǎng)基（pH 6.0），加入不同濃度配比的6－BA和IBA，建立9種培養(yǎng)基（表1），接種葡萄帶芽莖段，在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)15 d后觀察側(cè)芽萌發(fā)和不定根誘導(dǎo)情況。側(cè)芽萌發(fā)率（%）＝側(cè)芽萌發(fā)數(shù)／接種外植體總數(shù)×100；生根率（%）＝生根外植體數(shù)／接種外植體總數(shù)×100。

表1 側(cè)芽和不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基

1.2.4 以葉片和卷須為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選 在培養(yǎng)基B5＋30 g／L蔗糖＋7 g／L瓊脂＋1.5 g／L活性炭＋0.5 mg／L 6－BA中分別加入0、1.0、2.0 mg／L 2，4－D，建立3種培養(yǎng)基，如表2所示，調(diào)pH 6.0，分別接種克瑞森無核葡萄的葉片和卷須，培養(yǎng)條件同上，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。

表2 以葉片和卷須為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 0.1%升汞浸泡時間對克瑞森無核葡萄帶芽莖段消毒效果的影響

由表3可以看出，用0.1%升汞溶液消毒6 min時，既保證了污染率和褐變率較低，又獲得了較高的成活率，其污染率僅為10.0%，褐變率為16.7%，成活率為76.7%；而用0.1%升汞溶液消毒3 min時，污染率最高，為80.0%，褐變率和成活率均最低，分別為3.3%和16.7%?？梢?，用0.1%升汞溶液對克瑞森無核葡萄帶芽莖段處理時間短時，褐變率較低，但污染率高；隨處理時間延長，污染率低，但褐變率呈上升趨勢。因此，適宜克瑞森無核葡萄帶芽莖段外植體的消毒方法是先用75%酒精浸泡消毒1 min，再用0.1%升汞溶液消毒6 min，效果最好。

表3 0.1%升汞不同浸泡時間的克瑞森無核葡萄帶芽莖段消毒效果

2.2 不同抗褐變劑對克瑞森無核葡萄葉片外植體褐變的影響

將處理好的克瑞森無核葡萄葉片分別接種在添加不同抗褐變劑AC、PVP、VC的培養(yǎng)基上，在無菌條件下培養(yǎng)7 d后，葉片逐漸向培養(yǎng)基中凹陷，在傷口位置出現(xiàn)褐變現(xiàn)象（圖1）。從表4可以看出，不同種類抗褐變劑對葉片外植體褐變影響不同，褐變率表現(xiàn)為PVP＜AC＜VC，以添加VC的褐變率最高，達(dá)到45.0%；以添加PVP的褐變率最低，僅有25.0%。因此，對于克瑞森無核葡萄葉片外植體來說，抗褐變效果最好的是PVP。

表4 不同抗褐變劑對克瑞森無核葡萄葉片外植體褐變的影響

圖1 不同抗褐變劑處理下克瑞森無核葡萄葉片褐變情況

2.3 克瑞森無核葡萄不同器官離體培養(yǎng)的激素條件篩選

2.3.1 不同激素組合對克瑞森無核葡萄帶芽莖段側(cè)芽和不定根產(chǎn)生的影響 由表5和圖2可以看出，IBA和6－BA濃度配比不同，對克瑞森無核葡萄帶芽莖段的側(cè)芽和不定根誘導(dǎo)也不同。B52培養(yǎng)基的側(cè)芽和不定根誘導(dǎo)率均最高，分別為80.2%和78.8%；其次為B58培養(yǎng)基，側(cè)芽和不定根誘導(dǎo)率分別為78.5%和78.3%；而B51培養(yǎng)基的側(cè)芽誘導(dǎo)率僅為13.0%，且未產(chǎn)生不定根。B51、B55、B56培養(yǎng)基均未誘導(dǎo)出不定根，而這3種培養(yǎng)基中均未添加IBA，表明在誘導(dǎo)不定根產(chǎn)生的初代培養(yǎng)中IBA起到了主導(dǎo)作用。B51、B54、B56培養(yǎng)基的側(cè)芽長勢不好，芽細(xì)弱，而這3種培養(yǎng)基均未添加6－BA，說明6－BA對側(cè)芽的萌發(fā)有促進(jìn)作用。B58培養(yǎng)基雖然側(cè)芽萌發(fā)和不定根的誘導(dǎo)率也較高，但產(chǎn)生了大量的愈傷組織，這不利于側(cè)芽和不定根的生長，而這些愈傷組織可以通過繼代誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽得到再次利用。綜上，激素的使用對外植體側(cè)芽萌發(fā)和不定根誘導(dǎo)起到關(guān)鍵作用，以克瑞森無核葡萄帶芽莖段為外植體，適宜側(cè)芽萌發(fā)和不定根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基是B5＋30 g／L蔗糖＋7 g／L瓊脂＋1.0 mg／L 6－BA＋0.5 mg／L IBA。

圖2 不同激素組合培養(yǎng)基上克瑞森無核葡萄側(cè)芽和不定根生長情況

表5 不同激素組合對克瑞森無核葡萄帶芽莖段側(cè)芽和不定根產(chǎn)生的影響

2.3.2 2，4－D不同添加濃度對葉片和卷須外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響 從表6可以看出，以葉片為外植體進(jìn)行培養(yǎng)時，添加2，4－D可以明顯提高愈傷組織的誘導(dǎo)率，其中以添加1.0 mg／L 2，4－D（J2）的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，可達(dá)到91.7%，且愈傷組織生長旺盛，質(zhì)地緊密（圖3）。因此，適宜克瑞森無核葡萄葉片愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基是J2培養(yǎng)基。

圖3 不同濃度2，4－D處理下葡萄葉片的愈傷組織誘導(dǎo)情況

以卷須為外植體進(jìn)行培養(yǎng)時，添加2，4－D也明顯提高了愈傷組織的誘導(dǎo)率，以添加2.0 mg／L 2，4－D（J3培養(yǎng)基）的誘導(dǎo)率最高，為80.0%（表6），愈傷組織生長量多且質(zhì)地緊密（圖4）?？梢?，適合克瑞森無核葡萄卷須愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為J3培養(yǎng)基。

圖4 不同濃度2，4－D處理下葡萄卷須的愈傷組織誘導(dǎo)情況

表6 以葉片和卷須為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)情況

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)外植體的污染和褐變是植物組織培養(yǎng)的主要障礙。有關(guān)外植體消毒方面，前人已做過大量研究［8－12］，選用適合的藥劑是保證外植體消毒效果的關(guān)鍵，另外，消毒劑處理時間不同，消毒效果也不相同。外植體消毒殺菌處理時間越短，殺滅外植體所帶病菌越不徹底，培養(yǎng)基越容易發(fā)生霉變，而褐變率相對較低；處理時間越長，培養(yǎng)基污染率越低，但褐變率越高。陳云風(fēng)等［13］研究表明在消毒劑中加入抗生素能有效抑制細(xì)菌的生長；胡文斌等［14］認(rèn)為隴南紅提葡萄外植體采用75%酒精消毒60 s后再用0.1%升汞消毒8 min時的成活率適宜；沈傳進(jìn)等［15］的研究也表明無核白和早熟紅無核2個品種的外植體采用75%酒精消毒60 s后再用0.1%升汞（內(nèi)加1%食鹽）消毒8 min的效果最佳。賴呈純等［16］綜合考慮污染率和褐變率，認(rèn)為福建野生葡萄帶芽莖段使用升汞消毒9 min為宜。本研究結(jié)果表明，對于克瑞森無核葡萄帶芽莖段，先用75%酒精消毒60 s，再用0.1%升汞浸泡6 min的消毒效果最佳。

褐變現(xiàn)象在植物進(jìn)行離體培養(yǎng)時是普遍存在的［17］，但不同植物的適宜抗褐變劑種類及濃度不同。李張等［18］在研究抗褐變劑對南方紅豆杉愈傷組織褐變及相關(guān)物質(zhì)含量的影響中表明，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、活性炭（AC）、維生素C（VC）和硫代硫酸鈉（Na2S2O3）均有一定的抗褐變效果，以硫代硫酸鈉的效果最好。陳愛萍等［19］在苜蓿和紅豆愈傷組織繼代培養(yǎng)抗褐變的研究中，對PVP、檸檬酸與硝酸銀（AgNO3）的抗褐變效果進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，對愈傷組織褐變抑制效果較好的是AgNO3，這與郭鵬輝等［20］在藏藥柳茶中的研究結(jié)果一致。葉睿華等［21］在AgNO3、VC、AC、PVP、Na2S2O35種抗褐變劑對杜鵑蘭原球莖增殖培養(yǎng)的作用效果研究中發(fā)現(xiàn)，AC的抗褐變效果最佳。吳婉婉等［22］在茶樹莖段組織培養(yǎng)過程中選用AC與PVP 2種抗褐變劑，發(fā)現(xiàn)抗褐變效果最好的是AC。饒慧云等［23］在研究抗褐變劑對葡萄愈傷組織繼代培養(yǎng)過程中酚類物質(zhì)、相關(guān)酶及其基因表達(dá)的影響試驗中表明，PVP的抗褐變效果最好。本試驗以克瑞森無核葡萄的葉片為外植體，比較了PVP、AC與VC的抗褐變效果，結(jié)果表明抗褐變效果最好的是PVP，這與饒慧云等［23］的試驗結(jié)論相吻合。

植物激素的種類和濃度是影響植物愈傷組織誘導(dǎo)、側(cè)芽和不定根發(fā)生、繼代培養(yǎng)等的最重要因素［24，25］。外植體誘導(dǎo)部位不同，使用的生長調(diào)節(jié)激素不同。李國樹等［26］用不同的激素誘導(dǎo)葡萄外植體的不同部位，結(jié)果表明適宜葡萄莖尖誘導(dǎo)的培養(yǎng)基是1／2MS＋1.5 mg／L 6－BA＋0.10 mg／L IBA。賓宇波等［27］研究發(fā)現(xiàn)1／2MS＋0.1 mg／L NAA＋1.0 mg／L 6－BA為百花山葡萄不定根和側(cè)芽誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基。楊光等［28］研究發(fā)現(xiàn)狀元紅繼代培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基是1／2MS＋2.0 mg／L 6－BA ＋0.1 mg／L IBA。細(xì)胞分裂素與生長素的比例適中，對于保持繼代愈傷組織的快速生長是必要的［29］。黃貞光等［30］篩選出適合多個葡萄品種生長的廣譜B5培養(yǎng)基，其主要特點是含有較低的銨。本試驗結(jié)果表明，以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，克瑞森無核葡萄側(cè)芽和不定根誘導(dǎo)的適宜激素配方是1.0 mg／L 6－BA ＋0.5 mg／L IBA。

外植體類型的選擇對愈傷組織誘導(dǎo)極為重要。楊解解等［31］在文縣紋黨愈傷組織誘導(dǎo)的初步研究中發(fā)現(xiàn)，葉片的誘導(dǎo)率最低。常新等［32］在研究黑香蕉葡萄不同器官發(fā)生途徑再生體系的優(yōu)化試驗中，以葉片、莖尖分生組織和葉柄為外植體，發(fā)現(xiàn)用莖尖分生組織更容易誘導(dǎo)出再生體系。吳順等［33］在研究鉤藤愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生時，分別以嫩莖、嫩枝、嫩葉為外植體建立植株再生體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以嫩枝作為外植體的出愈情況較好。本試驗以克瑞森無核葡萄的葉片和卷須為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，結(jié)果表明，以葉片為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率較高，達(dá)91.7%。

本研究結(jié)果可為克瑞森無核葡萄的離體培養(yǎng)以獲得再生植株提供理論依據(jù)。