隋新瑩，劉國利，董春海

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109；2.無棣縣小泊頭鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，山東 無棣 251911）

鐵是植物生長所必需的微量元素之一［1］，多位于葉綠體內(nèi)，參與葉綠素的合成、細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)、呼吸作用、生物固氮、酶促反應(yīng)等重要生理過程［2］。鐵更是人體所必需的微量元素之一［3］，是人體血紅蛋白、肌紅蛋白的重要組成成分，能運(yùn)輸O2和CO2，也是過氧化氫酶和過氧化物酶的重要組成成分［4］。人體缺鐵會患缺鐵性貧血，從而引發(fā)營養(yǎng)不良、免疫力下降、生長發(fā)育遲緩、智力低下等病癥［5］，影響人們身體和心理的健康。據(jù)報(bào)道，缺鐵性貧血已成為僅次于結(jié)核病的全球患病率最高、耗資最大的公共衛(wèi)生問題［6］，在一定程度上阻礙社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。

治療缺鐵性貧血主要通過服用鐵營養(yǎng)素補(bǔ)充劑、調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)、食物強(qiáng)化以及生物強(qiáng)化等。其中，服用鐵營養(yǎng)素補(bǔ)充劑的方法見效快，但經(jīng)濟(jì)成本高且副反應(yīng)比較多［7］；調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)的方法在我國生活貧困家庭中將無法實(shí)現(xiàn)，且見效慢［8］；食物強(qiáng)化的方法簡單、有效，但成本也較高，且社會認(rèn)同度低。相比較而言，生物強(qiáng)化，即通過育種手段提高現(xiàn)有農(nóng)作物籽粒中微量營養(yǎng)元素鐵的含量，不僅具有生產(chǎn)簡單、易于接受的特點(diǎn)，而且食用方便、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，是防止和改善人體鐵元素缺乏最經(jīng)濟(jì)、最安全和最有效的方法之一［9］。目前，國內(nèi)外科技工作者已經(jīng)認(rèn)識到利用農(nóng)作物提高鐵營養(yǎng)的重要性，但有關(guān)鐵強(qiáng)化作物的育種研究較少，市場缺乏優(yōu)質(zhì)的鐵營養(yǎng)種植品種。

小麥?zhǔn)亲钪匾闹骷Z作物之一，全球約1／3的人口依賴小麥提供基本的營養(yǎng)需求。在全球人口日益增長的大環(huán)境下，利用現(xiàn)代育種手段提高小麥產(chǎn)量、提升其營養(yǎng)價(jià)值，無論對緩解人類營養(yǎng)需求的壓力還是保障我國糧食安全都具有極其重要的意義。前期研究中，我們利用化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯（EMS）對小麥主栽品種魯原502進(jìn)行誘變，并在鹽堿地高通量篩選獲得了耐鹽、高產(chǎn)新品系［10］。在此基礎(chǔ)上，又從耐鹽、高產(chǎn)新品系中篩選獲得了富鐵小麥新材料，并對與鐵元素吸收、運(yùn)輸相關(guān)的關(guān)鍵基因表達(dá)進(jìn)行了分析。這對于人們深入了解小麥中鐵營養(yǎng)元素的分子調(diào)控以及培育有益于人體健康的鐵營養(yǎng)強(qiáng)化作物都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥耐鹽、高產(chǎn)突變體材料來自于前期研究中利用化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯（EMS）對魯原502進(jìn)行誘變獲得的M3～M5代單株系［11］。小麥誘變及鹽堿地自然篩選于2016—2020年分別在山東省東營市利津縣毛坨村和濱州市無棣縣小泊頭鎮(zhèn)郭馬村試驗(yàn)田進(jìn)行。

1.2 測定項(xiàng)目及方法

1.2.1 小麥突變體幼苗根系的鐵敏感性分析 挑選籽粒飽滿的小麥種子于50 mL離心管中，加入40 mL去離子水和10 mL次氯酸鈉（去離子水∶次氯酸鈉＝4∶1），再加入15μL Triton X－100，于200～250 r／min搖床上振蕩15 min，重復(fù)兩次；再換成去離子水，清洗3次。將清洗完的種子置于4℃冰箱浸種過夜。然后將種子擺放在鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，加入10 mL EDTA－Fe溶液，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后觀察并記錄小麥幼苗的最長根生長。

1.2.2 小麥突變體籽粒鐵元素含量分析 將洗凈的種子于65℃烘箱中烘干，然后于粉碎機(jī)中充分粉碎，過1 mm篩。稱量1.0000 g粉碎好的樣品于消解管中，加入10 mL HNO3和2 mL HClO4，靜置過夜；在160℃的消解儀上加熱消解至溶液澄清透明且只剩1 mL左右，再加入10 mL去離子水，繼續(xù)加熱除酸后趁熱轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，混勻后靜置過夜。采用ICP－OES電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀對鐵元素含量進(jìn)行測定。

1.2.3 小麥突變體幼苗鐵相關(guān)基因的表達(dá)分析 將洗凈、浸泡好的種子擺放在鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，加入10 mL去離子水，置于25℃、16 h光照／8 h黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，用鑷子將其胚乳去除，再在1／5Hoagland營養(yǎng)液（無微量元素）中培養(yǎng)7 d，然后將培養(yǎng)液換成EDTA－Fe溶液（1.5 mmol／L），分別處理0、3、6、12、24 h后取材，用于RNA 提取。利用TIANGEN 公司的TRNzol Universal試劑盒進(jìn)行總RNA的提取。利用諾唯贊HiScriptⅢAll－in－one RT SuperMix Perfect for qPCR 試劑盒進(jìn)行g(shù)DNA 的合成。qRT－PCR分析采用諾唯贊公司的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒，所用引物由青島擎科公司合成。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用WPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥耐鹽突變體的鐵敏感性分析

前期研究中，我們利用EMS對小麥魯原502進(jìn)行遺傳誘變，經(jīng)過鹽堿地自然篩選獲得了約2 000個(gè)株系［10］。進(jìn)一步利用150 mmol／L NaCl脅迫處理篩選出430個(gè)耐鹽性強(qiáng)的株系。將這些耐鹽株系以等量種子（150 g）在同等面積（約20 m2）的鹽堿地上進(jìn)行模塊式種植，分別在2018、2019、2020年統(tǒng)計(jì)分析M3、M4、M5代的產(chǎn)量，篩選獲得了11個(gè)耐鹽小麥新品系，產(chǎn)量平均增幅在2.46%～31.52%。

為了分析這些耐鹽小麥突變體的鐵敏感性，我們先將野生型（WT）對照材料（魯原502）的種子置于不同濃度的EDTA－Fe溶液培養(yǎng)36 h，觀察比較幼苗根系對鐵的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)幼苗的最長根長隨鐵濃度增大先增加后減小，在EDTA－Fe濃度為1.5 mmol／L時(shí)達(dá)最大值，所以本試驗(yàn)選擇1.5 mmol／L為鐵敏感性的EDTA－Fe篩選濃度。

通過觀察外源鐵（1.5 mmol／L EDTA－Fe）處理對11個(gè)耐鹽小麥突變體幼苗最長根生長的影響（圖1 A），發(fā)現(xiàn)兩個(gè)突變體（LY 1－29和LY 2－7）的幼苗最長根長明顯大于野生型，而其它突變體幼苗的最長根長與野生型相近。進(jìn)一步利用不同濃度的EDTA－Fe（0、0.5、1.5、3.0、4.5 mmol／L）對這兩個(gè)突變體進(jìn)行處理，結(jié)果（圖1 B）表明，野生型（魯原502）和兩個(gè)突變體（LY 1－29和LY 2－7）的幼苗最長根長均在EDTAFe濃度為1.5 mmol／L時(shí)達(dá)到最大值；在高濃度EDTA－Fe（1.5、3.0、4.5mmol／L）處理下，兩個(gè)突變體（LY 1－29和LY 2－7）的幼苗最長根長均極顯著大于野生型對照（P＜0.01）。

圖1 小麥耐鹽突變體幼苗根系的鐵敏感性分析

2.2 小麥耐鹽突變體的籽粒鐵含量測定

為了深入了解小麥耐鹽突變體的鐵敏感性改變是否與內(nèi)源鐵元素含量有關(guān)，選取兩個(gè)鐵敏感性顯著降低的突變體（LY 1－29和LY 2－7）進(jìn)行鐵含量測定。結(jié)果（圖2）顯示，兩個(gè)突變體籽粒的鐵含量顯著高于野生型，其中，LY 1－29的籽粒鐵含量為80.00 mg／kg，比野生型的高126%；LY 2－7的籽粒鐵含量為76.39 mg／kg，比野生型的高115%。

圖2 小麥籽粒鐵含量測定

2.3 小麥耐鹽突變體中鐵相關(guān)基因的表達(dá)分析

小麥耐鹽突變體中鐵含量的增加可能與鐵吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)密切相關(guān)。為了解兩個(gè)突變體（LY 1－29和LY 2－7）中鐵含量增高的分子基礎(chǔ)，選取小麥中與鐵吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因進(jìn)行表達(dá)水平測定，包括TaYSL1（yellow stripe like，登錄號：TraesCS2B01G407900）、TaFIBP（ferric ion binding protein，登錄號：TraesCS1A01G019900）、TaIITT（iron transmembrane transporter，登錄號：TraesCS4B01－G219000）、TaRTH（RTE1－h(huán)omolog，登錄號：TraesCS5A02G445300）、TaZIP29［11］（zinc－regulated transporters and iron－regulated transporterlike protein，登錄號：TraesCS6D02G153800）。

qRT－PCR分析結(jié)果表明，這5個(gè)與鐵吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因在野生型和突變體中的表達(dá)模式各不相同，但均在鐵溶液處理的一定時(shí)間后呈現(xiàn)高水平表達(dá)（圖3）。值得特別關(guān)注的是，LY 1－29、LY 2－7兩個(gè)突變體中，這5個(gè)與鐵吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因表達(dá)量在鐵溶液處理后均不同程度地高于野生型對照。

圖3 EDTA－Fe處理下小麥富鐵突變體中鐵吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)分析

3 討論與結(jié)論

我國可耕地面積小，土地鹽漬化較為嚴(yán)重，導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量和營養(yǎng)價(jià)值降低。

甲基磺酸乙酯（EMS）是一種溫和的化學(xué)誘變劑，其誘變產(chǎn)生的點(diǎn)突變頻率高、染色體畸變少、破壞性小，且誘變具有隨機(jī)性，可獲得豐富的遺傳材料，在遺傳育種中廣泛應(yīng)用。在小麥中，如張維宏等［12］利用EMS誘變獲得6個(gè)葉銹病敏感型突變體；薛芳等［13］利用EMS誘變獲得7個(gè)抗性淀粉含量高的突變體；Zhang等［14］利用EMS誘變獲得晚抽穗突變體；趙天祥等［15］利用EMS誘變獲得特矮變異突變體。但EMS誘變在耐鹽小麥研究中應(yīng)用還較少。我們在前期研究中利用EMS誘變小麥栽培品種魯原502，經(jīng)鹽堿地自然篩選和高鹽（150 mmol／L）篩選，獲得了耐鹽、高產(chǎn)突變體株系［10］，為深入研究小麥耐鹽機(jī)制提供了新種質(zhì)。

研究表明，小麥等禾本科單子葉植物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)鐵元素的過程可分三步，首先缺鐵信號使植物根系向土壤中分泌一種可以與三價(jià)鐵螯合的麥根酸類物質(zhì)，該種物質(zhì)具有很強(qiáng)的螯合鐵離子的能力，能螯合6個(gè)三價(jià)鐵離子并形成穩(wěn)定的八面體結(jié)構(gòu)（Fe3＋－MAs）［16］；然后，位于植物根系細(xì)胞原生質(zhì)膜上的Fe3＋－MAs運(yùn)載系統(tǒng)能專一性地將Fe3＋－MAs轉(zhuǎn)運(yùn)至植物根系細(xì)胞質(zhì)中［17］；在細(xì)胞內(nèi)，三價(jià)鐵被還原成二價(jià)鐵，供細(xì)胞利用。與鐵吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的基因家族主要包括鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白家族（ZIP）、自然抗性相關(guān)巨噬蛋白家族（NRAMP）和黃色條紋蛋白家族（YSL）［2］。

本研究利用1.5 mmol／L EDTA－Fe從前期獲得的耐鹽突變體中篩選到了兩個(gè)富鐵的耐鹽小麥新材料LY 1－29和LY 2－7，兩者的籽粒鐵含量分別比野生型對照高126%和115%；經(jīng)外源鐵誘導(dǎo)，三價(jià)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TaFIBP、鐵離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TaIITT、Fe3＋－MAS螯合蛋白基因TaYSL1和TaZIP29均在兩材料體內(nèi)不同程度高水平表達(dá)，且表達(dá)水平高于野生型。說明這些基因的高水平表達(dá)可能是導(dǎo)致籽粒鐵元素增高的關(guān)鍵因素。AtRTH是AtRTE1的同源基因，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)擬南芥rth－1突變體對鐵離子處理不敏感，暗示該基因可能與鐵吸收運(yùn)輸有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，TaRTH在耐鹽、富鐵突變體材料中的表達(dá)受鐵離子誘導(dǎo)，且表達(dá)水平顯著高于野生型，這為深入了解RTH蛋白在鐵代謝中的功能提供了新材料。

中國營養(yǎng)學(xué)會《中國居民膳食營養(yǎng)參考攝入量》中推薦成年男性每日最佳鐵攝入量為15 mg，成年女性每日為20 mg［18］。但調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，目前人們的膳食水平無法達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)，鐵缺乏成為最大的“隱性饑餓”［6］。我國不同地區(qū)不同品種小麥籽粒中的鐵含量不同，大多數(shù)小麥栽培品種的鐵元素含量為32.5～65.6 mg／kg［19－22］。本研究獲得的兩個(gè)小麥耐鹽突變體的籽粒鐵含量分別為80.00 mg／kg和76.39 mg／kg，遠(yuǎn)高于市場上的小麥栽培品種，是優(yōu)質(zhì)的富鐵小麥新材料，為選育優(yōu)質(zhì)富鐵小麥品種提供了材料。