吳建霞，梁小剛，王 壟，劉琳琳，姜孝茍

（貴州茅臺酒股份有限公司質(zhì)量部，貴州仁懷 564501）

藍(lán)莓果實中除了常規(guī)的糖、酸和豐富的維生素外，還含有超氧化物歧化酶、熊果苷等物質(zhì),具有減緩衰老、增強記憶力、增強人體免疫機能等功能，深受廣大消費者喜愛[1-5]。藍(lán)莓也是世界糧農(nóng)組織推薦的五大健康水果之一[6-7]。但是，由于在生長過程中農(nóng)藥的不規(guī)范使用，極易造成藍(lán)莓果實的農(nóng)藥殘留超標(biāo)，因此對藍(lán)莓農(nóng)藥殘留的監(jiān)測顯得尤為重要[8]。目前，藍(lán)莓中農(nóng)藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9-11]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12-15]等，前處理方法主要為QuEChERS（快速Q(mào)uick,簡單Easy,廉價Cheap,高效Effective,耐用Rugged,安全Safe）方法[16]。

QuEChERS 方法原理是均質(zhì)的樣品用乙腈提取后，經(jīng)萃取分層，根據(jù)基質(zhì)分散萃取機理，采用吸附劑與基質(zhì)中的干擾物結(jié)合，通過離心除去，從而達(dá)到凈化的目的。QuEChERS 方法具有快速、簡單、廉價、高效、安全等優(yōu)點，且有機溶劑用量少，減少了環(huán)境污染，目前被廣泛用于食品、環(huán)境、生物等多種領(lǐng)域[17-24]。QuEChERS 方法還可以根據(jù)不同的樣品基質(zhì)選擇吸附劑種類來消除基質(zhì)或色素干擾，目前常用吸附劑有PSA、C18、GCB 等。藍(lán)莓中農(nóng)藥殘留的檢測,因其色素含量高,基質(zhì)復(fù)雜等因素面臨諸多困難。目前已有研究報道基于QuEChERSLC-MS/MS 法檢測藍(lán)莓中的農(nóng)藥殘留[25]，但監(jiān)測農(nóng)藥范圍小且方法不適于拓展。本文建立一種基于QuEChERS 樣品前處理與氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）檢測相結(jié)合的快速多殘留分析方法，實現(xiàn)對藍(lán)莓中192 種農(nóng)藥的測定,此方法操作簡便，定性定量分析結(jié)果準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

藍(lán)莓樣品：市售。

試劑及耗材：甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、丙酮（色譜純），德國Merck 公司；Bond Elut QuECh-ERS EN 提取試劑盒，美國Agilent Technologies 有限公司，內(nèi)含4 g MgSO4、l g NaCl、1 g 檸檬酸鈉和0.5 g 檸檬酸氫二鈉；Bond Elut QuEChERS EN 分散SPE 凈化試劑盒，美國Agilent Technologies 有限公司,內(nèi)含900 mg 無水MgSO4和150 mg 乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）；分散劑填料C18，上海安普公司；S-74897 農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 μg/mL），百靈威科技有限公司。

儀器設(shè)備：三重四極桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,配有電子轟擊源（Electron impaction source,EI），美國Agilent 公司；10～5000 μL 移液器，德國Eppendorf公司；ME204E電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；Velocity 18R 多功能臺式高速冷凍離心機，英國Dynamica 公司；Talboys 漩渦混合器，美國Troemner公司；勻漿機，德國博朗。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

將藍(lán)莓鮮果加入勻漿機中制成果漿,準(zhǔn)確稱取5.00 g 果漿樣品（精確至0.01 g）于50 mL 離心管中，加入10 mL 乙腈，將離心管置于多管的漩渦振蕩器上振蕩提取10 min 后放入冰箱冷凍（-18 ℃）15 min。加入QuEChERS 提取試劑包，振搖使其分散均勻，漩渦振蕩5 min，于-20 ℃冷凍離心機中9000 r/min 離心5 min 備用。準(zhǔn)確吸取3 mL 上清液于15 mL 凈化離心管中，加入500 mg C18粉末，漩渦振蕩5 min，于-20 ℃冷凍離心機中9000 r/min 離心5 min，取上清液待分析。

1.2.2 基質(zhì)溶液制備

選擇陰性藍(lán)莓樣品（經(jīng)檢測不含任一種目標(biāo)農(nóng)藥）按1.2.1 樣品預(yù)處理方法制備空白藍(lán)莓基質(zhì)溶液備用。

1.2.3 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用已制備好的空白藍(lán)莓基質(zhì)溶液作為標(biāo)準(zhǔn)稀釋液,將多組混合農(nóng)藥標(biāo)液配制成LM-1 和LM-2兩個混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再分別配得濃度為5 μg/kg、10 μg/kg、20 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg、500 μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.2.4 儀器工作條件

氣相色譜條件：Agilent HP-5MS UI（15 m ×0.25 mm，0.25 μm）色譜柱；氦氣作為載氣，純度≥99.999%，流速1.0 mL/min；進樣口溫度280 ℃；不分流進樣模式；進樣量1 μL；升溫程序：60 ℃保持1 min，然后以40 ℃/min 升溫至120 ℃，再以5 ℃/min 升溫至310 ℃，保持3 min，總運行時間為40.5 min。

質(zhì)譜條件：離子源類型為EI；離子源溫度：280 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；離子化電壓：70 eV；四極桿溫度：Q1 150 ℃，Q2 150 ℃；溶劑延遲時間3.75 min；質(zhì)譜信號采集模式為多反應(yīng)檢測模式（MRM）,192 種農(nóng)藥名稱、保留時間、儀器分析參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

利用乙腈、丙酮和甲醇3 種提取溶劑分別做目標(biāo)農(nóng)藥的加標(biāo)回收實驗，考察其對萃取效果的影響。結(jié)果顯示，采用乙腈作為提取溶劑，163種農(nóng)藥回收率均在70 %～120 %之間，滿足檢測要求，而用丙酮、甲醇做提取溶劑時部分化合物回收率只有30 %～50 %，此外根據(jù)參考文獻(xiàn)[26]，QuEChERS 方法多數(shù)采用乙腈作為提取劑，因此，本實驗采用乙腈作為提取劑。

同時，對比了加入5 mL、10 mL、15 mL 乙腈對提取效果的影響。結(jié)果表明：加入5 mL 乙腈時，多數(shù)目標(biāo)農(nóng)藥回收率無法滿足檢測要求；加入10 mL、15 mL 乙腈目標(biāo)農(nóng)藥的回收率均在70%～120%之間，且均滿足檢測要求，因此選擇10 mL 乙腈作為最終提取方案。

2.2 凈化方式

藍(lán)莓果漿較多的脂肪酸、脂類和色素會對目標(biāo)農(nóng)藥的檢測造成較大影響。實驗以Bond Elut QuEChERS EN 分散SPE 凈化試劑盒為基礎(chǔ),對比了4組不同的凈化吸附材料組合,具體情況見表1。

表1 凈化吸附材料情況

通過對比各組凈化吸附材料下目標(biāo)農(nóng)藥的平均回收率,發(fā)現(xiàn)第3 組回收率為75%～112%，比較集中且滿足檢測要求。最終選擇900 mg MgSO4+150 mg PSA+500 mg C18進行凈化。

2.3 目標(biāo)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分析

基于安捷倫G9250AAMRM 數(shù)據(jù)庫為檢測農(nóng)藥提供的8 個MRM 離子對，從而選擇合適的3 對離子對進行測定，將基質(zhì)干擾降至最低，將配制好的LM-1 和LM-2 兩個混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液用藍(lán)莓基質(zhì)稀釋至100 μg/kg，按照已優(yōu)化的儀器分析條件進行檢測，圖1、圖2 為兩組混標(biāo)總離子流（TIC）圖。由圖可見，藍(lán)莓基質(zhì)干擾效應(yīng)極低,各目標(biāo)農(nóng)藥得到了較好的分離，完全滿足定性和定量檢測的要求，這主要得益于對樣品提取液進行的針對性凈化以及多反應(yīng)檢測模式（MRM）的抗干擾優(yōu)勢。

圖1 LM-1混合標(biāo)樣MRM圖

圖2 LM-2混合標(biāo)樣MRM圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用已制備好的藍(lán)莓基質(zhì)溶液配制LM-1 和LM-2 混合標(biāo)準(zhǔn)系列，分別配制成濃度為5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、500 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，經(jīng)GC-MS/MS 檢測得到對應(yīng)的信號響應(yīng)值,以峰面積對質(zhì)量濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)，以信噪比（S/N）≥3 確定檢出限，結(jié)果見表2。從表2 可看出，192 種農(nóng)藥在藍(lán)莓基質(zhì)中均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r 范圍在0.9904～0.9999 之間，檢出限為0.24～300.5 μg/kg，滿足分析檢測要求。

表2 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的質(zhì)譜條件、方法的檢出限、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和平均回收率

2.5 準(zhǔn)確度和精密度

按1.2.1 樣品預(yù)處理方法對藍(lán)莓進行192 種農(nóng)藥添加量分別為20 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg 的添加回收試驗，每個水平重復(fù)8 次，密草通等29 種農(nóng)藥因檢出限較高未作添加回收實驗。為避免定量誤差，使用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)標(biāo)樣計算分析物回收率,還通過分析基于溶劑的標(biāo)樣對基質(zhì)效應(yīng)進行了評價。192 種農(nóng)藥回收率在76.8 %～109.1 %范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.7 %～24.9 %之間，詳見表2。結(jié)果表明，該方法的回收率和精密度都能滿足分析的要求，具有良好的回收率和重現(xiàn)性。

續(xù)表2（一）氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的質(zhì)譜條件、方法的檢出限、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和平均回收率

2.6 實際樣品檢測

為進一步驗證方法的適用性,按照上述的QuEChERS-三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用法對市售的10 個藍(lán)莓樣品進行檢測,結(jié)果均未檢出目標(biāo)農(nóng)藥。

續(xù)表2（三）氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的質(zhì)譜條件、方法的檢出限、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和平均回收率

3 結(jié)論

本實驗開發(fā)了一種QuEChERS 與GC-MS/MS相結(jié)合簡單而穩(wěn)定的方法,用于測定藍(lán)莓中的192種農(nóng)藥。各農(nóng)藥組分在5～500 μg/kg 范圍內(nèi),呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7 %～24.9 %，測定藍(lán)莓中各農(nóng)藥組分的加標(biāo)回收率為76.8 %～109.1%。該方法在目標(biāo)農(nóng)藥上獲得了滿意的定量回收率,操作簡便,定性定量準(zhǔn)確,適用于分析藍(lán)莓中的多農(nóng)藥殘留,可以滿足標(biāo)準(zhǔn)和常規(guī)的農(nóng)藥殘留監(jiān)測要求。此外,該方法對其他各類漿果的農(nóng)藥殘留檢測有很大的借鑒意義,為漿果常規(guī)農(nóng)藥殘留的監(jiān)測提供了較好的方法補充。