胡 楊，李先芝，2，劉 洋，林 露，石 豪，毛瓊麗，嚴(yán) 玲

（1.勁牌有限公司，湖北大冶 435112；2.中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北大冶 435112）

甲醛是一種具有刺激性氣味的細(xì)胞原生質(zhì)毒物，作為一種代謝成分普遍存在于生物體中，通過破壞生物體中的蛋白質(zhì)和酶，使得組織細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的損傷。早有研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期處于甲醛環(huán)境中會(huì)對(duì)人體機(jī)能造成影響，比如嘔吐、腹痛、誘發(fā)哮喘[1]、急性炎癥[2]、呼吸道損傷[3]、白血病[4]等。因此，甲醛被世界衛(wèi)生組織確定為致癌和致畸物質(zhì)[5]，同時(shí)歐洲食品安全管理局（EFSA）建議經(jīng)口攝入甲醛每天不得超過11 mg/kg[6]。雖然我國(guó)頒布的《食品衛(wèi)生法》中明文規(guī)定禁止向食品中添加甲醛，但由于甲醛在防腐保鮮[7]、殺菌消毒[8]、增白等方面具有顯著效果，一些不法商人將甲醛加入食品中，以達(dá)到提高食品亮澤度、延長(zhǎng)保存期、改善口感等目的。

目前，有關(guān)食品中甲醛含量檢測(cè)主要集中在肉制品[9]、水產(chǎn)品[10]、啤酒[11]等領(lǐng)域，對(duì)白酒中甲醛含量檢測(cè)的研究較少。甲醛檢測(cè)主要有分光光度法[12-13]、熒光

法[14-15]、色譜法[16]等。其中高效液相色譜法因具有靈敏度高、準(zhǔn)確度好、干擾小、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)被廣泛運(yùn)用于各行業(yè)中的甲醛含量檢測(cè)[17]。因此，本研究在此基礎(chǔ)上開發(fā)建立一種白酒中甲醛含量檢測(cè)方法，以期為我國(guó)白酒中甲醛含量檢測(cè)及食品安全提供科學(xué)有效的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料與試劑

樣品：不同品牌市售白酒。

試劑及耗材：甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL，北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司)；甲醇、乙腈（HPLC 級(jí)，美國(guó)Fisher 公司）；2,4-二硝基苯肼（HPLC 級(jí)，美國(guó)Sigma 公司）；乙酸鈉、乙酸（分析級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)有限公司）；水為超純水。

1.1.2 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀（賽默飛公司，UltiMate 3000，美國(guó)），電子分析天平（賽多利斯SQP，德國(guó)），數(shù)控超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，中國(guó)），PURELAB-超純水儀（PURELAB classic UV，英國(guó)），數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司，中國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制

2,4-二硝基苯肼溶液：精密稱取2,4-二硝基苯肼適量至容量瓶中，用乙腈溶解并定容，制備成濃度為1.5 mg/mL的2,4-二硝基苯肼的溶液。

乙酸鈉緩沖液：準(zhǔn)確稱取2.64 g 乙酸鈉，用超純水溶于500 mL 的容量瓶中，用乙酸調(diào)節(jié)pH 值至5。

衍生液：將2,4-二硝基苯肼溶液和乙酸鈉緩沖液按照1∶1（V∶V）混合。

1.2.2 供試品溶液的制備

精確量取白酒樣品0.8 mL 于10 mL 具塞比色管中，加入衍生液至刻度線，搖勻，置于60 ℃水浴中衍生30 min，取出，冷卻至室溫，取適量樣品過0.22 μm有機(jī)相濾膜，即得。

1.2.3 色譜條件

色譜柱為Inertsil ODS-3-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇∶水（68∶32，V∶V），柱溫40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，進(jìn)樣量20 μL，等度洗脫。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生條件的優(yōu)化

2.1.1 衍生時(shí)間的確定

為確定最佳的衍生時(shí)間，在維持衍生溫度不變的前提下，改變衍生的時(shí)間，比較在不同衍生時(shí)間下測(cè)得衍生產(chǎn)物含量的峰面積，結(jié)果如圖1 所示。在60 ℃衍生溫度條件下，隨著衍生時(shí)間從15 min到30 min，衍生產(chǎn)物的峰面積呈逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì)；當(dāng)衍生時(shí)間超過30 min時(shí)，衍生產(chǎn)物的峰面積逐漸下降。因此，確定最佳衍生時(shí)間為30 min。

圖1 不同衍生時(shí)間衍生物峰面積變化曲線

2.1.2 衍生溫度的確定

為確定最佳的衍生溫度，在維持衍生時(shí)間不變的前提下，改變衍生溫度，比較在不同衍生溫度下測(cè)得衍生產(chǎn)物含量的峰面積，結(jié)果如圖2 所示。隨著衍生溫度從40 ℃到60 ℃，衍生物的峰面積逐漸增大；當(dāng)衍生溫度從60 ℃上升到70 ℃時(shí)，衍生物的峰面積開始逐漸減少，說明當(dāng)溫度較低時(shí)，衍生不充分，而溫度過高則會(huì)使衍生物不穩(wěn)定。因此，確定最佳衍生溫度為60 ℃。

圖2 不同衍生溫度衍生物峰面積變化曲線

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

分別精確量取不同體積的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10 mL 具塞比色管中，加衍生液至刻度線，混勻，配制成不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液置于60 ℃水浴中衍生30 min，取出冷卻至室溫。精確吸取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，注入液相色譜，按照1.2.3 色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，得到各濃度的色譜峰的峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性關(guān)系及范圍，見圖3，在0.0125～1.0 mg/L 濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=10.544X+0.0648（R2=1.0000）。該方法的檢出限為1.5 μg/mL，能滿足白酒樣品中甲醛含量的檢測(cè)。

圖3 甲醛衍生物標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一白酒樣品，按照1.2.2 供試品溶液制備方法制備供試品，按1.2.3 色譜條件進(jìn)行連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，檢測(cè)結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.20 %，表明該方法具有良好的精密度。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取已知含量的同一批次的白酒樣品0.4 mL，共9 份，分別添加不同水平的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.2 供試品制備方法進(jìn)行樣品制備，按照1.2.3 色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算甲醛的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。由表2 可知，甲醛的加標(biāo)回收率在93.27%～98.06%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.98%，表明本方法準(zhǔn)確度高，可以滿足白酒樣品中的甲醛含量檢測(cè)。

表2 甲醛加標(biāo)回收率(n=9)

2.5 樣品檢測(cè)

用建立的方法對(duì)不同品牌市售白酒中甲醛含量進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表3。由表3 可知，不同品牌市售白酒中的甲醛含量不同，這可能與其釀造工藝有關(guān)。

表3 市售白酒樣品中甲醛檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

我國(guó)是白酒消費(fèi)大國(guó)，隨著社會(huì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對(duì)酒的品質(zhì)和安全越來越重視。但由于原料及釀造工藝的原因，使得白酒中殘留微量甲醛。本研究建立了高效液相色譜法測(cè)定白酒中微量甲醛含量的檢測(cè)方法，采用Inertsil ODS-3-C18色譜柱，以甲醇和水為流動(dòng)相等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，準(zhǔn)確度高，能夠很好的運(yùn)用于白酒中甲醛含量檢測(cè)，為白酒中甲醛含量檢測(cè)提供參考依據(jù)。