黃 婷，黃 河，劉茗銘，楊亞嬌，王 媚，馮方劍，趙金松，

(1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 644000；2.四川省酒業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司川酒研究院，四川成都 610000)

蒲公英（Taraxacum mongolicumHand.-Mazz.）是一種菊科蒲公英屬多年生宿根性植物，又稱華花郎、黃花地丁、婆婆丁等，具有一種多收、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，在我國大多數(shù)地區(qū)均有種植[1]。由于蒲公英含黃酮類化合物、多酚類化合物以及蒲公英色素等多種生理活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抑菌、降血脂等功能特性[2-3]，逐漸應(yīng)用于醫(yī)藥[4]（治療乳腺和婦科疾?。┖捅＝∈称奉I(lǐng)域[5]（蒲公英飲品），被國家衛(wèi)生部列為藥食同源的物品[6]。成熟期的蒲公英含有較為豐富的活性功能因子，但口感苦澀，不利于食用，目前一般作為中藥使用，較大程度上限制了蒲公英作為食用性山野產(chǎn)品的利用價值。因此，加強(qiáng)蒲公英功能性食品的開發(fā)和深加工研究，對蒲公英產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

露酒不僅具有相應(yīng)的植物香和酒香[7]，且含有多種功能活性因子，使其具有特定的保健功能，符合當(dāng)代人追求健康生活的需求，但由于中國傳統(tǒng)白酒等烈性酒種一直是國內(nèi)酒行業(yè)的主流，目前大量研究主要集中在名優(yōu)酒的生產(chǎn)工藝及風(fēng)味影響因素（窖泥、糟醅及曲藥等[8-10]）上，對具有一定功能性的露酒等小酒種研究開發(fā)力度較低，致使露酒行業(yè)發(fā)展不平衡[11]。隨著人們生活水平提高，人們對營養(yǎng)和健康要求也不斷提高，目前，現(xiàn)有的露酒產(chǎn)品種類不能滿足當(dāng)下露酒市場非常巨大的需求，促使露酒新產(chǎn)品開發(fā)成為酒類研究的熱點(diǎn)。蒲公英植株含有多種功能因子，且藥食同源，較適合作為露酒產(chǎn)品開發(fā)的原材料。

本研究采用輔助超聲技術(shù)和粉碎處理對蒲公英進(jìn)行預(yù)處理，以甘草、金銀花和薄荷為輔料，濃香型白酒為酒基，并以總黃酮浸出量和總多酚浸出量為響應(yīng)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)及響應(yīng)面設(shè)計(jì)對浸提條件進(jìn)行優(yōu)化?；谏鲜鰞?yōu)化條件，通過感官評價及活性成分分析，探究有效成分含量與復(fù)合型蒲公英露酒風(fēng)味變化的相關(guān)性，為具備功能性蒲公英類露酒開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：以“蒲公英”為關(guān)鍵詞，在藥智數(shù)據(jù)-中藥方劑數(shù)據(jù)庫檢索得127 個組方，其中與金銀花、甘草、薄荷配伍頻次高達(dá)125 次，金銀花配伍占比49.21 %，甘草配伍占比42.86 %，薄荷配伍占比7.14%，為復(fù)合型蒲公英露酒功能性提供了科學(xué)理論支撐。蒲公英，甘草，金銀花，薄荷，2020年7月采購于成都中和百康大藥房；濃香型酒基（60%vol），四川省酒業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司川酒研究院提供。

試劑及耗材：沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（99.8%，-18 ℃避光保存），蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（99.4 %，2～8 ℃低溫保存），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；福林酚試劑（避光保存），中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉（AR級），甲醇（色譜純），硝酸鋁（AR級），亞硝酸鈉（AR 級），碳酸鈉（AR 級），成都煌羽實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

儀器設(shè)備：ST-04A 粉碎儀，上海樹立儀器儀表有限公司；T2600 紫外可見分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；HWS-26型恒溫水浴鍋，DHG-9240（A）電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；超聲儀，昆山潔力美有限責(zé)任公司；UPT-1-10T 超純水，四川優(yōu)普超純科技有限公司；AX224ZH 電子天平，常州奧豪斯儀器有限公司；HWS 恒溫恒濕培養(yǎng)箱，北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)工藝流程

原材料→分選整理→粉碎過20 目篩→輔助超聲處理→浸提（濃香型白酒（60%vol）按需降度處理）→澄清、過濾處理→調(diào)配（冰糖等糖類，檸檬酸等酸類，調(diào)配酒等）→裝罐儲存（陳釀）→過濾→分析檢測→成品露酒

1.2.1.1 輔助超聲處理[12-13]

為有效節(jié)約浸提時間和保持黃酮等化合物（對熱不穩(wěn)定）功能活性，采取超聲輔助處理，其原理是超聲波在提取溶媒中產(chǎn)生的空化效應(yīng)和機(jī)械作用，一方面可有效地破碎植物細(xì)胞壁，使有效成分呈游離狀態(tài)并溶入提取溶媒中，另一方面可加速提取溶媒的分子運(yùn)動，使得提取溶媒和有效成分快速接觸，相互溶合。研究表明[25]，在葛根露酒的制備中，通過超聲處理，在相同條件下浸提黃酮類化合物，能夠明顯縮短浸提時間，因此，本文采取超聲輔助處理。

1.2.1.2 浸提處理

本試驗(yàn)所選原料的有效成分大多存在于細(xì)胞原生質(zhì)中的液泡中，待原料干燥后，黃酮等有效成分固結(jié)于細(xì)胞內(nèi)，且干燥導(dǎo)致細(xì)胞半透膜遭到破壞的情況下，加以超聲輔助處理，利于有效成分的浸出[14]。浸提過程包括4個階段：一是潤濕，當(dāng)干燥粉碎的原料與酒基（浸提溶劑）接觸時，酒基先附著在原材料表面，使其潤濕，而后通過毛細(xì)管和細(xì)胞間隙進(jìn)入細(xì)胞組織；二是溶解，酒基進(jìn)入細(xì)胞組織后，將可溶性有效成分（黃酮、多酚等）及無效雜質(zhì)溶解，即細(xì)胞組織內(nèi)溶液形成，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，促使更多酒基進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而造成細(xì)胞不斷膨脹至破裂，利于浸提有效進(jìn)行；三是擴(kuò)散，基于溶解過程，在細(xì)胞內(nèi)形成濃溶液且具有高滲透壓，使細(xì)胞內(nèi)有效成分不斷透過細(xì)胞膜向外擴(kuò)散，在原材料表面形成一層高濃度膜（邊界層），細(xì)胞內(nèi)的有效成分通過該膜向四周擴(kuò)散，直至細(xì)胞內(nèi)外濃度一致，此時擴(kuò)散停止；四是置換，原材料表面的高濃度溶液被低濃度的酒基置換，保持整個浸提體系內(nèi)具有較大濃度差，有利于有效成分的溶出[15]。

1.2.1.3 工藝要點(diǎn)

對蒲公英、甘草、金銀花和薄荷進(jìn)行分選除梗后，粉碎處理過20 目篩，并按一定物料比稱量，備用；將酒基(60 %vol 濃香型白酒)用無菌蒸餾水按需降度，將原料與濃香型酒基以一定料液比混合，進(jìn)行輔助超聲處理，并保溫10 min，攪拌后于室溫下進(jìn)行浸提處理，取樣周期為1 d(在取樣前12 h 內(nèi)禁止攪拌)，于冰箱低溫保存(2～8 ℃)；浸提完成后通過澄清過濾處理，得到復(fù)合型蒲公英露酒原液；由經(jīng)專業(yè)訓(xùn)練過的品評師進(jìn)行露酒原液感官評價，根據(jù)感官品評結(jié)果進(jìn)行調(diào)配，從而得到風(fēng)味及營養(yǎng)功能俱佳的復(fù)合型蒲公英露酒。

1.2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在露酒浸提過程中，分別對乙醇濃度、料液比、物料比、超聲功率、超聲時間、超聲溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)。將蒲公英、甘草、金銀花和薄荷粉碎處理至過20 目篩后，選擇酒基乙醇濃度為30%vol、35%vol、40%vol、45%vol、50%vol、55%vol、60%vol；料液比（m∶v）為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07；物料比（蒲公英占比，m∶m）為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8；超聲功率為200 W、220 W、240 W、250 W、260 W、280 W、300 W；超聲時間為5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min；超聲溫度為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃，在常溫避光條件下浸提7 d，每個處理組重復(fù)3 次，采集數(shù)據(jù)126組。

1.2.3 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

Plackett-Burman 試驗(yàn)（P-B 試驗(yàn)）是一種在影響因素較多時，可以通過最少試驗(yàn)次數(shù)估計(jì)因素的主效應(yīng)，科學(xué)、高效地篩選出重要影響因素的兩水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法[16]，用于研究影響復(fù)合型蒲公英露酒中黃酮和多酚浸出量的6 個工藝參數(shù)：酒基乙醇濃度、料液比、物料比、超聲功率、超聲時間、超聲溫度，從中篩選出顯著影響因素，用于響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析。根據(jù)2.1 結(jié)果綜合分析，設(shè)定各因素高（1）、低（-1）兩個水平的取值，以黃酮和多酚的綜合值Y作為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及編碼見表1所示。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

1.2.4 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)回歸方程中各因素的系數(shù)確定最陡爬坡試驗(yàn)的步長和爬坡方向，以最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果的最大相應(yīng)值作為響應(yīng)面試驗(yàn)分析的中心點(diǎn)[17]。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

由最陡爬坡試驗(yàn)確定了酒基乙醇濃度、料液比、超聲溫度3 個因素取值的中間點(diǎn)，在優(yōu)化的發(fā)酵條件基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design-Expert.10 軟件和Box-Behnken 設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，分別以酒基乙醇濃度、料液比、超聲溫度作為變量，并選用適當(dāng)?shù)乃?，以黃酮和多酚的綜合值Y 作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3 因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平及編碼值如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平表

1.2.6 總黃酮浸出量測定[18]

黃酮類化合物的鄰二酚羥基、酮羰基和鄰位酚羥基在堿性條件下和鋁離子配位，生成穩(wěn)定黃色絡(luò)合物在510 nm 產(chǎn)生強(qiáng)吸收。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：顯色體系為在5支25 mL比色管中加入0.30 mL 5.00%NaNO2后，分別加入0.00 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL 的0.1 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（CAS 號：153-18-4，50 %甲醇為溶劑），搖勻靜置6 min 后，加入0.30 mL 10 %Al(NO3)3，搖勻靜置6 min，加入4.00 mL 的4 % NaOH，50 %甲醇溶液定容至10 mL，搖勻靜置10 min 后在510 nm 處測定吸光度，擬合回歸方程為Y=0.0746x-0.0003，R2=0.9987，其中x 為OD510值，Y 為總黃酮浸出量（mg/mL）。

酒樣中黃酮浸出量測定：將所取酒樣用50 %甲醇溶液稀釋25倍后，按上述方法測定。

1.2.7 總多酚浸出量測定[19]

Fonlin-Ciocalteu 法：在堿性溶液中，F(xiàn)onlin-Ciocalteu 試劑中鎢鉬酸可以將多酚類化合物定量氧化，其自身被還原生成藍(lán)色的化合物，藍(lán)色的深淺程度與含酚基團(tuán)的數(shù)目成正比。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精確稱取0.0070 g 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號：149-91-7）于50 mL容量瓶中，用超純水定容，備用。分別在7支50 mL比色管中依次加入5.00 mL超純水和2.50 mL的2 mol/L Fonlin-Ciocalteu試劑，搖勻后，依次加入0.00 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL 的0.12 mg/mL 沒食子酸溶液，搖勻靜置30 s 后，加入4.00 mL 的12 %濃度的碳酸鈉，超純水定容至25 mL，于45 ℃水浴鍋中保溫90 min，在760 nm 處測定其吸光度，擬合回歸方程為Y=0.0074x-0.00005，R2=0.999，其中x 為OD760值，Y為總多酚浸出量（mg/mL）。

酒樣中總多酚浸出量測定：將所取酒樣用超純水稀釋10倍后，按上述方法測定。

1.2.8 感官評價

根 據(jù)GB/T 27588—2011《露 酒》[20]、NY/T 2104—2018《綠色食品 配制酒》[7]和GB/T 33405—2016《白酒感官品評術(shù)語》[21]等國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行復(fù)合型蒲公英露酒感官評價標(biāo)準(zhǔn)制定（表3），由經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)的品酒師進(jìn)行盲評打分（國家級評委占比20%，省級評委占比20%）。

表3 復(fù)合型蒲公英露酒感官評價標(biāo)準(zhǔn)

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert.10 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并利用SPSS.22 統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多重比較與q檢驗(yàn)。重復(fù)3次。

在響應(yīng)面分析中，對黃酮和多酚的檢測指標(biāo)采用Hassan 方法[22]，將各指標(biāo)均歸一化為0～1 之間的值。如公式1：

式中：di：每組試驗(yàn)所得的真實(shí)值；dmax：實(shí)驗(yàn)組中的最高值；dmin：試驗(yàn)組中的最低值。

考慮到黃酮和多酚均是蒲公英復(fù)合型露酒中重要的活性成分且黃酮浸出量相對較高，因此，將黃酮和多酚的權(quán)重值分別設(shè)為0.6 和0.4，得到黃酮和多酚的綜合值Y，如公式2：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)（圖1）

圖1 不同因素水平對黃酮、多酚浸出量的影響

如圖1（b）所示，料液比對黃酮浸出量和多酚浸出量具有顯著影響（p＜0.05）。黃酮浸出量隨料液比的增加呈上升后趨于穩(wěn)定趨勢，料液比達(dá)到0.06 時，黃酮浸出量達(dá)到最大值，為0.256 mg/mL，此后黃酮浸出量趨于穩(wěn)定；多酚浸出量隨料液比的增加呈上升后下降趨勢，在料液比為0.06 時，多酚浸出量達(dá)到最大值，為0.028 mg/mL，明顯高于其他料液比的多酚浸出量（P＜0.05），這與朱定國[23]復(fù)合型露酒工藝參數(shù)優(yōu)化研究結(jié)果一致。綜上，選取0.5、0.7 兩個水平的料液比參數(shù)進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)。

如圖1（c）所示，黃酮浸出量隨物料比（蒲公英添加量）增加呈上升后趨于平穩(wěn)趨勢，蒲公英添加量為0.4 時，黃酮浸出量達(dá)到峰值，為0.266 mg/mL，此后增加蒲公英添加量，黃酮浸出量趨于穩(wěn)定；多酚浸出量隨蒲公英添加量增加呈先上升后下降趨勢，且蒲公英添加量為0.3 時，多酚類含量達(dá)到峰值，為0.028 mg/mL，該露酒多酚類化合物浸出規(guī)律與溫華婷等[24]試驗(yàn)結(jié)果一致。綜上，選取0.3、0.5兩個水平的蒲公英添加量進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)。

如圖1（d）所示，在超聲功率為200～240 W時，黃酮和多酚浸出量均呈上升趨勢，并在超聲功率為240 W 時，達(dá)到峰值，分別為0.168 mg/mL、0.024 mg/mL，此功率下黃酮和多酚浸出量顯著高于其他處理組（P＜0.05）；此后隨超聲功率的增加，黃酮和多酚浸出量呈下降趨勢，這一試驗(yàn)結(jié)果與邱遠(yuǎn)[25]葛根露酒工藝研究結(jié)果一致。一方面可能是由于超聲功率增強(qiáng)，空化等效應(yīng)隨之增強(qiáng)，導(dǎo)致已浸出的有效成分可能發(fā)生某些化學(xué)反應(yīng)（如氧化反應(yīng)），致使黃酮含量降低，另一方面可能是隨超聲功率增強(qiáng)，對黃酮等生物活性成分的分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，致使測定結(jié)果偏低。綜上，選取220 W、250 W兩個水平的超聲功率進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)。

如圖1（e）所示，隨超聲時間的增加，黃酮和多酚浸出量呈上升后下降趨勢，且超聲時間為20 min時，達(dá)到峰值，分別為0.294 mg/mL、0.026 mg/mL，即顯著高于其他處理組（p＜0.05）。綜上，選取15 min、25 min 兩水平的超聲時間進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)。

如圖1（f）所示，超聲溫度對黃酮和多酚浸出量具有顯著影響（p＜0.05）。隨超聲溫度升高，黃酮和多酚浸出量呈上升后下降趨勢，且超聲溫度為35 ℃時，達(dá)到峰值，分別為0.275 mg/mL、0.026 mg/mL，即顯著高于其他處理組（p＜0.05）。超聲溫度適當(dāng)升高時，促進(jìn)植物組織纖維膨脹，加快可溶性成分的溶解速度和擴(kuò)散速度，促使黃酮等有效成分的溶出，且有利于露酒和浸出物的穩(wěn)定性（蛋白質(zhì)被凝固變性，降低酶活，殺死微生物等），但當(dāng)超聲溫度不斷升高時，將導(dǎo)致黃酮等不耐熱成分分解變質(zhì)以及無效雜質(zhì)大量累積，隨之露酒中有效成分含量降低，且酒體渾濁帶絮狀物[26]。綜上，選取30 ℃、40 ℃兩個水平的超聲溫度進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Plackett-Burman試驗(yàn)和方差分析（表4、表5），從乙醇濃度、液料比、物料比、超聲功率、超聲時間、超聲溫度6 個因素中篩選獲得影響黃酮和多酚浸出量的關(guān)鍵因素。通過選用N=6，試驗(yàn)組數(shù)為12 次的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定生產(chǎn)工藝參數(shù)的主要影響參數(shù)，通過Plackett-Burman程序擬合獲得的試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5 Plackett-Burman試驗(yàn)方差分析

2.2.1 方差分析

由表5 可知，該試驗(yàn)設(shè)計(jì)模型F=83.20，p＜0.0001，即模型呈現(xiàn)極顯著，且模型決定系數(shù)R2=0.9901，R2adj=0.9782，說明該模型與試驗(yàn)擬合程度較好，誤差較小，可用此模型快速、有效地篩選出主要影響因素；影響黃酮和多酚浸出量的關(guān)鍵因素依次為B＞A＞F＞D＞E＞C，即料液比＞乙醇濃度＞超聲溫度＞超聲功率＞超聲時間＞物料比，料液比（B）對綜合值Y 具有極顯著影響（F=442.17，p＜0.001），酒基乙醇濃度（A）與超聲溫度（F）對綜合值Y 具有顯著影響（P＜0.05），但物料比（C）、超聲功率（D）、超聲時間（E）對綜合值Y 不具有顯著性影響（P＞0.05）。因此選擇料液比、酒基乙醇濃度和超聲溫度3個主要因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析。

8.牛呼吸道合胞體病毒感染。牛呼吸道合胞體病毒病是由病毒引起的牛的一種急性、熱性呼吸道傳染病，臨床以高熱、持續(xù)性呼吸困難為主要特征。

2.2.2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

響應(yīng)面擬合方程只在接近最佳值考察區(qū)域才近似真實(shí)情況，為了有效地建立響應(yīng)面擬合方程則需逼近此區(qū)域，常用最陡爬坡法快速逼近最佳值區(qū)域[27]。因此為了最大限度接近黃酮和多酚浸出量的真實(shí)值，選擇酒基乙醇濃度、料液比和超聲溫度作為主要考察因素，根據(jù)各效應(yīng)系數(shù)確定爬坡方向，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

黃酮和多酚的綜合值Y 隨工藝參數(shù)變化呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在第4 組和第5 組試驗(yàn)中多酚、黃酮浸出量分別達(dá)到最大值，且其中第4 組試驗(yàn)中綜合值Y 為0.970，達(dá)到最優(yōu)試驗(yàn)結(jié)果，表明各顯著影響因素在生產(chǎn)體系中已接近最優(yōu)范圍，即酒基乙醇濃度為46%vol，料液比為0.06，超聲溫度為3 ℃，以此工藝條件為中心點(diǎn)進(jìn)行下一步Box-Behnken試驗(yàn)分析。

2.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3.1 回歸模型的建立和方差分析

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，以第4 組試驗(yàn)為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過Box-Behnken 程序進(jìn)行交互二次回歸擬合，以綜合值Y 為響應(yīng)值，析因部分試驗(yàn)12 次，中性點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)次數(shù)5 次，Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表7。全編碼水平的二次回歸方程如下：

表7 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Y=0.95-0.13A+0.017B-0.017C+0.058AB+0.10AC+5.414×10-3BC-0.26A2-0.14B2-0.34C2

由表8 方差分析可知：該二次回歸模型達(dá)到極顯著水平（F=32.31，p＜0.01）；模型中失擬項(xiàng)F=0.0746，P＞0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，說明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢韵鄬陀^良好反應(yīng)各個因素與綜合值Y 之間的關(guān)系;回歸方程決定系數(shù)R2=0.9765，確定因素R2adj=0.9463，說明該模型可解釋90 %響應(yīng)值變化，即綜合值Y 的變化有90%來自所取自變量因素乙醇濃度、料液比和超聲溫度3 項(xiàng)條件的變化。該二階回歸方程對實(shí)驗(yàn)擬合情況好，說明試驗(yàn)方法的可靠性比較高，可用于黃酮和多酚浸出量試驗(yàn)綜合值的理論預(yù)測?；貧w方程中A、C、A2和C2對綜合值Y影響極顯著（p＜0.01），AC、B2對綜合值Y影響顯著（p＜0.05），B、AB、BC、C2不顯著（p＞0.05）。由此可知，各因素對黃酮和多酚浸出量綜合值Y 的影響程度主次順序?yàn)椋篈＞C＞B，即乙醇濃度＞超聲溫度＞料液比。

表8 Box-Behnken試驗(yàn)方差分析

2.3.2 顯著因素水平的優(yōu)化

為了更直觀反映乙醇濃度（A）、料液比（B）和超聲溫度（C）三因素之間的交互作用對綜合值Y的影響，利用Design-Expert10 軟件繪制出各因素與響應(yīng)值之間三維空間曲線圖和等高線圖（圖2）。響應(yīng)面圖形的響應(yīng)值是實(shí)驗(yàn)中各試驗(yàn)因子A、B 和C 兩兩交互作用，及最佳參數(shù)和各參數(shù)之間的相互作用所構(gòu)成的曲面圖，曲面越陡峭，各因素對響應(yīng)值的影響就越顯著；同一等高線上的每個點(diǎn)代表的數(shù)值相同，而等高線的形狀可反映各因素之間交互作用的顯著性，等高線為橢圓形，則試驗(yàn)因子兩兩交互作用差異性顯著，若為圓形則差異性不顯著。

圖2 各因素交互作用對綜合響應(yīng)值Y的響應(yīng)面

回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)乙醇濃度（A）、料液比（B）、超聲溫度（C）的編碼值分別為45.453 %vol、0.0652、35.499 ℃，此時綜合值Y 為0.995，黃酮和多酚的含量分別為0.299 mg/mL 和0.037 mg/mL。即當(dāng)乙醇濃度、料液比和超聲溫度分別為45.453%vol、0.0652 和35.499 ℃時，該模型預(yù)測的最大綜合值Y為0.995，黃酮和多酚的含量最大估計(jì)值分別為0.299 mg/mL 和0.037 mg/mL。考慮投入實(shí)際生產(chǎn)中，將露酒生產(chǎn)工藝參數(shù)修正為：乙醇濃度、料液比和超聲溫度分別為45%vol、0.065和35 ℃。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為表明響應(yīng)面模型的有效性，對其結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。利用優(yōu)化調(diào)整后的浸提工藝條件（乙醇濃度45 %vol、料液比0.065、超聲溫度35 ℃）進(jìn)行3 組平行試驗(yàn)，露酒中黃酮和多酚浸出量分別為0.294 mg/mL、0.036 mg/mL；以未優(yōu)化工藝條件為對照組進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，且試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測值進(jìn)行對比，其結(jié)果見圖3 所示，應(yīng)用優(yōu)化后的工藝參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)，黃酮和多酚浸出量都顯著高于優(yōu)化前（p＜0.05）；驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測值差異不顯著（p＞0.05）。

圖3 黃酮和多酚浸出量優(yōu)化驗(yàn)證

2.4 不同浸提時間對有效成分浸出量和風(fēng)味的影響

基于上述優(yōu)化條件，研究隨浸提時間的延長，黃酮和多酚的浸出規(guī)律和該露酒風(fēng)味變化（圖4）。在浸提過程中，復(fù)合型蒲公英露酒中黃酮浸出量呈上升后趨于穩(wěn)定的趨勢，即在1～4 d 內(nèi)，浸提時間與浸出量成正比，適當(dāng)延長浸提時間有利于浸提量的增加，但當(dāng)擴(kuò)散達(dá)到平衡時（4～9 d），浸提時間的增加未對有效成分的浸出起作用，主要原因是黃酮類化合物為醇溶性化合物，浸提前期酒基中黃酮浸出量較低，加快其浸出速率，后期物料中黃酮類化合物溶出量和被消耗量（氧化）達(dá)到近似平衡，此外，過度延長浸提時間將導(dǎo)致露酒中存在大量無效雜質(zhì)，不利于露酒風(fēng)味的形成；而多酚浸出量則呈上升后下降趨勢，即在浸提前期（1～4 d），多酚類化合物的浸出量隨浸提時間的延長而增加，浸提中后期，多酚類化合物的浸出量與浸提時間成反比，造成這一現(xiàn)象的原因是與黃酮類化合物相比，多酚類化合物被氧化的程度較嚴(yán)重，浸提后期多酚類化合物被消耗量大于浸出量，不能達(dá)到動態(tài)平衡。

圖4 浸提時間對黃酮、多酚浸出量及露酒風(fēng)味的影響

對不同浸提時間段的復(fù)合型蒲公英露酒進(jìn)行了感官評價，試驗(yàn)結(jié)果表明，隨浸提時間的延長，感官評分呈上升后降低趨勢。浸提前期酒體澄清，但植物香清淡；當(dāng)浸提時間為4 d 時，該露酒呈透明、黃棕色澤，植物香突出，酒香濃厚綿長，諸味協(xié)調(diào)且能持久，感官評分最高為87.6 分，此后隨浸提時間延長，酒體呈黃褐色、透明度下降、微渾且有異味。這是由于浸提后期無效雜質(zhì)浸出量增加，隨著浸提時間的延長酒體微渾、失光或氧化變色且不悅感明顯增強(qiáng)。結(jié)合有效成分的浸出規(guī)律和該露酒感官評價可知，在浸提時間為4 d 時，有效成分的浸出量和感官評分均為峰值。

3 結(jié)論

經(jīng)過優(yōu)化浸提工藝參數(shù)后，確定有效成分浸出量的最佳浸提條件為：乙醇濃度45 %vol，料液比0.065，物料比0.4，超聲功率240 W，超聲時間20 min，超聲溫度20 ℃。在此條件下得到的復(fù)合型蒲公英露酒中總黃酮含量達(dá)0.294 mg/mL，總多酚含量達(dá)0.036 mg/mL，分別是未優(yōu)化前的1.18 倍和1.23倍。此外，基于優(yōu)化條件，研究并明確了該露酒不同浸提時間黃酮和多酚的浸出規(guī)律及風(fēng)味變化，即在浸提時間為4 d時，黃酮和多酚浸出量達(dá)到峰值，分別為0.295 mg/mL、0.036 mg/mL，此時酒體澄清透明，顏色呈黃棕色光澤，酒香濃郁，同時保留了蒲公英等原料獨(dú)特的風(fēng)味特征（感官評分為87.6分）。試驗(yàn)結(jié)果為提高黃酮和多酚（具有功能活性）的浸出量，以及為提高復(fù)合型蒲公英露酒品質(zhì)增補(bǔ)一些資料基礎(chǔ)，對豐富露酒品種，增強(qiáng)蒲公英相關(guān)產(chǎn)品的深加工與開發(fā)以及帶動地方產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)提供數(shù)據(jù)參考。