李靜雯，張東亞，陸 洋，許譯文

（貴州省輕工業(yè)科學(xué)研究所，貴州貴陽 550007）

米酒是我國傳統(tǒng)特色食品，具有較高的營養(yǎng)價值[1]。目前，國內(nèi)外有關(guān)米酒的研究主要集中在發(fā)酵工藝條件優(yōu)化[2]、成分分析[3]、原料分析[1，4]以及酒曲制作及研究[5]等方面，而有關(guān)低度米酒的制作工藝及發(fā)酵動力學(xué)的研究分析較少。

發(fā)酵動力學(xué)是生化反應(yīng)工程的基礎(chǔ)內(nèi)容之一，以研究發(fā)酵過程的反應(yīng)速率和環(huán)境因素對速率的影響為主要內(nèi)容[6]。貴州省輕工業(yè)科學(xué)研究所聯(lián)合多家單位制作的單工位多模態(tài)智能發(fā)酵罐，其設(shè)計是基于發(fā)酵過程的工藝控制。因此，通過發(fā)酵動力學(xué)的研究，可進一步了解各發(fā)酵參數(shù)之間的關(guān)系，為發(fā)酵過程的工藝控制、發(fā)酵罐的設(shè)計放大和利用計算機對發(fā)酵過程進行控制提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：糯米，五常市錦鴻米業(yè)有限公司；酒曲，昆明市呈貢吉兆酒曲廠。

試劑及耗材：超純水，自產(chǎn)；平板計數(shù)瓊脂，上海博微生物科技有限公司；氯化鈉（分析純），成都金山化學(xué)試劑有限公司。

儀器設(shè)備：Testo 205 便攜式pH 計，德圖儀表（深圳）有限公司；0-50 %手持折光儀，深圳鼎鑫宜；超純水儀，Heal Force Easy15；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮；SPX-150 生化培養(yǎng)箱，上海豫明；JA2003 電子天平，上海浦春計量儀器有限公司；LS-75HD立式滅菌器，濱江醫(yī)療；SW-CJ-2FB超凈工作臺，上海豫明。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程及操作要點

本試驗采用工藝流程：糯米→浸泡→蒸煮→加漿→拌曲→發(fā)酵→過濾→殺菌→成品

操作要點：

（1）浸泡：浸泡糯米水溫在20～30 ℃之間，浸泡時間為7～12 h。

（2）加漿量：加漿量為米重的2.5倍。

（3）拌曲：拌曲溫度應(yīng)在35 ℃±2 ℃。

（4）發(fā)酵：發(fā)酵前2 d，每24 h 攪拌1 次，發(fā)酵48 h后進行密閉發(fā)酵。

（5）過濾：先使用50 目網(wǎng)篩過濾，再使用100 目的尼龍布進行過濾即得。

（6）殺菌：采用超聲波（15 min）與脈沖強光協(xié)同紫外（10 min）聯(lián)合殺菌。

1.2.2 單因素試驗

將低度米酒的發(fā)酵基礎(chǔ)條件設(shè)為酒曲添加量0.7%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間為7 d，以感官評分作為評價指標，分別對酒曲添加量0.3 %、0.5 %、0.7%、0.9%；發(fā)酵溫度25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃；發(fā)酵時間5 d、7 d、9 d、11 d 進行試驗，觀察不同條件對低度米酒感官評分的影響。

1.2.3 正交試驗

為確定低度米酒的最佳發(fā)酵工藝，經(jīng)單因素分析，選擇影響米酒品質(zhì)的因素，進行正交試驗。

1.2.4 發(fā)酵過程參數(shù)測定

在最佳工藝條件下，每24 h 進行菌落總數(shù)、糖度、酒精度、pH值的測定，具體檢測方法如下。

菌落總數(shù)測定：參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》進行測定。

酒精度測定：參考GB 5009.225—2016《食品國家安全標準酒中乙醇濃度的測定》進行測定。

pH值測定：采用便攜式pH計進行測定。

TSS測定：采用折光儀測定，并以°Bx表示。

1.2.5 感官品評方法

感官品評方法首先用0～4 評判法[7]確定各指標的權(quán)重，再利用模糊數(shù)學(xué)感官評價法[8]對發(fā)酵型低度米酒進行品評，所有的評價指標分為4 個等級：優(yōu)秀(90 分)、良好(80 分)、中等(70 分)、較差(60分)。感官要求參考T/GZSX 017—2020《貴州米酒》中發(fā)酵型米酒感官品評要求，詳見表1。

表1 米酒(發(fā)酵型)感官要求

1.2.6 發(fā)酵動力學(xué)模型的建立

根據(jù)低度米酒發(fā)酵過程中菌落生長情況、酒精含量、pH 生成和TSS 消耗建立菌群生長、酒精生成、酸性物質(zhì)生成和TSS消耗的動力學(xué)模型。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用Origin 2021 軟件進行繪圖，并對低度米酒發(fā)酵過程中菌落總數(shù)、酒精含量、酸性物質(zhì)生成量、TSS 消耗量進行非線性擬合。通過回歸求解動力學(xué)模型參數(shù)，建立菌落總數(shù)生長、酒精生成、酸性物質(zhì)生成和TSS 消耗的動力學(xué)模型方程。利用Excle進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，SPSS 26.0進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 評價指標權(quán)重分析

將各指標之間進行兩兩比較，如果重要程度較大則記為1，否則為0，指標自身不進行比較[8]。指標權(quán)重評判共6 人(3 男，3 女)，評價結(jié)果如表2所示。

表2 評價指標權(quán)重分布

綜上所述，將低度米酒評價指標權(quán)重計為N=(0.23,0.26,0.31,0.20)。感官品評時所有參評人員(8人)只給出每個指標的優(yōu)秀、良好、中等、較差共4個等級的評判，最終進行計算統(tǒng)計。

2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1 加曲量對感官品評的影響

由圖1 可知，加曲量為0.3%時，由于用曲量少發(fā)酵不充分，TSS(5.5 %)、酒精度(6.1 %vol)較其他組低，感官上風(fēng)味及滋味偏向甜酒釀。

圖1 加曲量對感官品評的影響

隨著酒曲添加量的增加，在0.7 %時發(fā)酵的米酒，米香較好，且口感好，因此適宜的酒曲添加量為0.7%。對加曲量進行顯著性分析，結(jié)果表明，加曲量在0.3 %～0.7 %之間感官評分結(jié)果差異顯著（p＜0.05），其他加曲量之間差異不顯著（p＞0.05），通過該試驗確定以加曲量0.6%、0.7%、0.8%作為正交試驗的3個水平。

2.2.2 發(fā)酵溫度對感官品評的影響

由圖2 可知，當(dāng)發(fā)酵溫度在40 ℃時，由于溫度過高，導(dǎo)致米酒苦味重，且酸度較大(pH 3.46)，因此感官評分較低(73.49 分)。而發(fā)酵溫度低于30 ℃時，微生物生長較為緩慢，外觀較黏稠，因此感官評分較低(76.98分)。

圖2 發(fā)酵溫度對感官評分的影響

經(jīng)顯著性分析，40 ℃下的感官評分與30 ℃、35 ℃的感官評分差異顯著（p＜0.05）。發(fā)酵溫度在25 ℃、30 ℃、35 ℃時，感官評分差異不顯著(p＞0.05)，綜上所述，試驗確定以28 ℃、30 ℃、32 ℃作為正交試驗發(fā)酵溫度的3個水平。

2.2.3 發(fā)酵時間對感官評分的影響

由圖3 可知，在一定溫度和酒曲添加量下，隨著發(fā)酵時間的延長，感官評分呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。

圖3 發(fā)酵時間對感官評分的影響

經(jīng)數(shù)據(jù)分析，發(fā)酵時間之間差異不顯著(p＞0.05)，發(fā)酵7 d 和發(fā)酵11 d 之間差異顯著（p＜0.05）。當(dāng)發(fā)酵時間為5 d 時，由于發(fā)酵時間較短，產(chǎn)生的酒度低，米香淡，發(fā)酵時間延長至11 d 時，其酸度增加，苦味較突出[9]，發(fā)酵時間過長或過短所得成品感官均較差。因此，選擇發(fā)酵時間6 d、7 d、8 d作為正交試驗發(fā)酵時間的3個水平。

2.3 正交試驗結(jié)果與分析

為確定低度米酒的最佳配方，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取影響低度米酒品質(zhì)的3 個主要因素，即加曲量(A)、發(fā)酵溫度(B)和發(fā)酵時間(C)，采用L9(33)正交實驗法，對各因素水平的設(shè)置見表3。

表3 各因素水平對照表

根據(jù)上表進行正交試驗，正交試驗結(jié)果及極差分析見表4。

表4 正交試驗結(jié)果及極差分析

正交實驗方差分析結(jié)果見表5。

表5 正交試驗方差分析結(jié)果

由表4 和表5 可知，對低度米酒發(fā)酵影響順序為發(fā)酵時間(C)＞發(fā)酵溫度(B)＞加曲量(A)，最優(yōu)水平為C2B1A2，即發(fā)酵時間7 d，發(fā)酵溫度28 ℃，加曲量0.7 %，此時感官評分最高為82.08 分，此時TSS 13.5°Bx，pH3.98，酒精度11.4%vol。

2.4 重復(fù)試驗結(jié)果

將感官評分差異不顯著的A2B1C2與A2B3C1進行重復(fù)試驗，試驗結(jié)果見表6。

表6 重復(fù)試驗結(jié)果

由表6 可知，A2B1C2感官評分略高于A2B3C1，因此最終確定最佳發(fā)酵工藝為發(fā)酵時間7 d，發(fā)酵溫度28 ℃，加曲量0.7%。

2.5 低度米酒主要指標變化情況

2.5.1 發(fā)酵過程主要指標的檢測

基于最優(yōu)工藝條件，對發(fā)酵過程主要指標(菌落總數(shù)、酒精度、pH 值、TSS)進行測定，變化曲線見圖4。

圖4 低度米酒發(fā)酵過程主要指標變化圖

由圖4 可知，從第5 天開始，TSS 含量減少趨勢緩慢，并逐漸趨于穩(wěn)定，這可能是由于酵母菌也在這一時期開始逐漸衰亡，底物消耗逐漸減弱，這也預(yù)示著發(fā)酵基本完成。發(fā)酵過程中酒精度含量在發(fā)酵前2 d 變化很小，一方面是由于酵母菌處于生長適應(yīng)階段，還未完全進行產(chǎn)酒精作用；另一方面是由于前2 d 進行有氧發(fā)酵，此時糖化酶作用于發(fā)酵醪中的淀粉、糊精將其水解生成糖類、有機酸類物質(zhì)，因此糖度較高，酒精度低，pH 值下降快，有氧微生物繁殖速度較快。

從發(fā)酵第3 天開始，進入無氧發(fā)酵階段，該階段糖度下降快，酒精度快速上升，又有發(fā)酵醪中的蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下，水解生成小分子的蛋白質(zhì)、肽和各種氨基酸的反應(yīng)，這些水解產(chǎn)物，一部分被酵母細胞吸收合成菌體，另一部分則發(fā)酵生成了酒精和二氧化碳，還產(chǎn)生副產(chǎn)物雜醇油、甘油等，該過程pH 值下降程度變緩，酵母菌開始大量繁殖，將糖轉(zhuǎn)化為酒精，導(dǎo)致酒精度大幅度上升，在發(fā)酵第7 天酒精度達到最大值，為11.6 %vol。從酒精度、TSS 含量、菌落總數(shù)以及pH 值隨發(fā)酵的變化上看，四者之間相互聯(lián)系，變化符合發(fā)酵規(guī)律。

2.5.2 菌落總數(shù)生長模型建立

菌群的生長動力學(xué)模型大多使用Monod 和Logistic 方程。Monod 方程表述簡單、應(yīng)用范圍廣泛，但僅適用于細胞生長較慢和細胞密度較低的環(huán)境下[10]；而Logistic 方程描述菌體生長情況，可以反映出發(fā)酵過程中因菌體的增加而抑制自身生長的作用，對擬合菌體生長過程具有一定的適用性[11]，因此通過Logistic方程進行擬合。

式中：Y 表示發(fā)酵過程中菌落總數(shù)，×106cfu/mL；A1表示初始菌落總數(shù)，×106cfu/mL；A2表示最終菌落總數(shù)，×106cfu/mL；x表示發(fā)酵時間，d；x0、p 為方程系數(shù)。

通過origin2021 軟件對菌體數(shù)量和方程式(1)進行擬合，得到A1=2.63538，A2=7.06471，x0=2.81754，p=6.182，帶入式(1)得菌落總數(shù)隨發(fā)酵過程變化的動力學(xué)模型式(2)。

菌落總數(shù)生長試驗值與預(yù)測值模型擬合曲線如圖5所示。

圖5 菌落總數(shù)擬合曲線

在低度米酒的發(fā)酵過程中，菌群的生長代謝決定了產(chǎn)物的生成以及基質(zhì)的消耗。由于糯米中富含支鏈淀粉[14]，因此前兩天有氧發(fā)酵階段，菌群主要產(chǎn)生糖化酶將淀粉轉(zhuǎn)化為糖元，這與TSS 消耗情況相對應(yīng)。由圖5 可知，發(fā)酵過程中菌落總數(shù)的變化曲線的擬合度較好，Logistic 模型R2=0.98669，表明該模型能較好的反映菌落總數(shù)的生長情況。

2.5.3 酒精生成發(fā)酵動力學(xué)模型建立

酒精的生成是微生物主要能量代謝的直接結(jié)果，產(chǎn)物的生成和細胞的生長是同步的和完全偶聯(lián)的[12]。因此，利用與菌落總數(shù)相同的方程進行擬合。

式中：Y 表示發(fā)酵過程中酒精度，%vol；A1表示初始酒精度，%vol；A2表示最終酒精度，%vol；x 表示發(fā)酵時間，d；x0、p 為方程系數(shù)。

通過origin 2021 軟件對酒精度和方程式（3）進行擬合，得到A1=0.85547，A2=11.6873，x0=3.56228，p=7.78307，帶入式（3）得酒精度隨發(fā)酵過程變化的動力學(xué)模型式（4）。

酒精生成試驗值與預(yù)測值模型擬合曲線如圖6所示。

圖6 酒精度擬合曲線

由圖6 可知，由于酒曲中含有多種菌群，因此前2 d 有氧發(fā)酵階段依然有酒精生成，進入無氧發(fā)酵階段酒精生成速率加快，當(dāng)菌群進入到穩(wěn)定期和衰亡期，產(chǎn)酒精作用逐步減緩，曲線平緩下降[15]。發(fā)酵過程中酒精度的變化曲線的擬合度較好，Logistic模型R2=0.98922，表明該模型能較好的模擬酒精的生成。

2.5.4 酸類物質(zhì)生成動力學(xué)模型建立

酸類物質(zhì)的生成既與菌體生長速率有關(guān)，也與菌體濃度有關(guān)。發(fā)酵過程中由于微生物對培養(yǎng)基中碳源、氮源等的利用，隨著有機酸或氨基氮的積累，會使酸度產(chǎn)生一定的變化[6]。因此，采用Boltzmann模型建立該方程。

式中：Y 表示發(fā)酵過程中pH 值；A1表示初始pH 值；A2表示最終pH值；x表示發(fā)酵時間，x0、dx為方程系數(shù)。

通過origin 2021 軟件對pH 值和方程式（5）進行擬合，得到A1=4.50978，A2=3.97569，x0=3.01584，dx=0.92478，帶入式（5）得pH 值隨發(fā)酵過程變化的動力學(xué)模型式（6）。

酸類物質(zhì)生成試驗值與預(yù)測值模型擬合曲線如圖7所示。

圖7 酸類物質(zhì)生成發(fā)酵動力學(xué)模型

酸類物質(zhì)的生成與微生物生長部分偶聯(lián)，產(chǎn)物是能量代謝的間接結(jié)果[12]。在微生物的作用下，有氧發(fā)酵過程中根霉及乳酸菌分解產(chǎn)生乳酸等有機酸，使得pH 值快速下降；無氧發(fā)酵過程中酵母菌的酒精發(fā)酵作用將有機酸降解為酒精等小分子物質(zhì)，因此pH值逐漸下降速率變緩[13]。由圖7可知，發(fā)酵過程中酸類物質(zhì)生成的變化曲線的擬合度較好，Boltzmann 模型R2=0.99194，表明該模型能較好的模擬酸類物質(zhì)的生成。

2.5.5 基質(zhì)消耗動力學(xué)模型建立

在低度米酒的發(fā)酵過程中，TSS 的消耗模型屬于底物消耗，基質(zhì)底物是菌種生長代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)，又涉及產(chǎn)物的合成。在微生物發(fā)酵過程中，主要消耗在三個方面：一是用于合成新的細胞物質(zhì)，二是用于合成代謝產(chǎn)物，三是提供細胞生命活動的能量[6，12]。通過物料平衡，利用Boltzmann模型建立方程如下。

式中：Y 表示發(fā)酵過程中TSS 的值，°Bx；A1表示初始TSS 的值，°Bx；A2表示最終TSS 的值，°Bx；x 表示發(fā)酵時間，x0、dx為方程系數(shù)。

通過origin 2021 軟件對TSS 和方程式（7）進行擬合，得到A1=28.66602，A2=13.55812，x0=2.5768，dx=0.7125，帶入式（7）得TSS 隨發(fā)酵過程變化的動力學(xué)模型式（8）。

圖8 基質(zhì)消耗反應(yīng)動力學(xué)模型

TSS 中大部分為可溶性糖[16]，糖作為微生物生長代謝必須的碳源，其生成與糯米淀粉水解有關(guān)[17]，主要是由于在前48 h 有氧發(fā)酵階段，酒曲中的根霉、毛霉等大量生長繁殖，產(chǎn)生糖化酶，將糯米中的支鏈淀粉轉(zhuǎn)化為糖元，為后續(xù)酵母、細菌等利用其產(chǎn)生酒精提供充足的基質(zhì)。在擬合方程中，選擇了擬合度較高的Boltzmann 方程進行擬合，其R2=0.99631，表明該模型能較好的模擬基質(zhì)的消耗。

3 結(jié)論與討論

通過對低度米酒工藝的探究，確定了最佳發(fā)酵工藝為加曲量0.7%，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時間7 d，進行重復(fù)試驗后監(jiān)測其發(fā)酵過程菌落總數(shù)、酒精度、pH值和TSS的變化，并進行了模型建立，且4個監(jiān)測值的模型擬合程度較好，分別為0.98669、0.98922、0.99194 和0.99631。但是由于監(jiān)測設(shè)備受限，未進行含氧量（DO）的監(jiān)測，且由于酒曲中菌群復(fù)雜，無法利用比濁度進行菌液含量的測定，因此試驗僅是對低度米酒發(fā)酵過程進行了粗略的檢測，可作為發(fā)酵罐設(shè)計所需的基礎(chǔ)發(fā)酵工藝參考數(shù)據(jù)。