滕 娟，滕曉燕，史文秀，陳 楠

（江蘇雙溝酒業(yè)股份有限公司，江蘇宿遷 223800)

配制酒，又稱調制酒，是酒類里面一個特殊的品種，不專屬于哪個酒的類別，是混合的酒品。近年來隨著人們生活水平的提高，在大健康產業(yè)的帶動以及健康消費理念的推動下,保健型配制酒得到較快發(fā)展，由于保健型配制酒中含有有益于人體健康的多糖、皂苷、黃酮類等營養(yǎng)物質而比普通白酒更具有養(yǎng)生功效，越來越被消費者所喜愛。其含有的多糖(polysaccharide)是由糖苷鍵結合的糖鏈，至少由超過10個的單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物，可用通式(C6H10O5)n表示。多糖不是一種純粹的化學物質，而是聚合程度不同的物質的混合物。研究證明，多糖能夠促進免疫系統(tǒng)功能，讓免疫系統(tǒng)能夠不斷生產自然殺手細胞、干擾素、白細胞介素來摧毀已經存在的癌細胞，進而維護整個免疫系統(tǒng)的健康平衡。但是關于配制酒中多糖的檢測方法還沒有出臺針對性的國家標準。沒有統(tǒng)一標準，各企業(yè)均根據實際情況來制定自己的企業(yè)標準，檢驗方法都還在不斷摸索與完善中。

本實驗主要運用乙醇沉淀法來進行配制酒中多糖的提取，通過對提取過程的分析，可以發(fā)現(xiàn)多糖提取主要涉及乙醇提取濃度、冷藏溫度和水提溫度3個實驗條件。通過單因素試驗和正交試驗找出最佳乙醇提取濃度、最佳冷藏溫度、最佳水提溫度，從而對配制酒多糖檢測的前處理過程中設計的實驗條件進行明確與完善，提高配制酒檢測中多糖的提取效率，提高檢測準確性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：市售白酒及保健型配制酒產品。

試劑及耗材：多糖標準品、無水乙醇、硫酸、苯酚、無水葡萄糖等。

儀器設備：紫外分光光度計、離心機、控溫醫(yī)用冷藏箱、電爐、溫度計、移液管等。

1.2 試驗方法

1.2.1 理論依據

1.2.1.1 關鍵實驗條件分析

（1）乙醇提取濃度：多糖類物質由于其分子中含有大量的極性基團，與水有較大的親和力，易溶于水而不溶于乙醇等醇類物質。

（2）冷藏溫度：低溫環(huán)境條件下可使多糖從高濃度的乙醇溶液中析出。

（3）水提溫度：多糖極易溶于熱水。

1.2.1.2 試驗原理

（1）采用乙醇沉淀法提取多糖，多糖類物質由于其分子中含有大量的極性基團，與水有較大的親和力，易溶于水而不溶于乙醇等醇類物質。且多糖極易溶于熱水。隨著乙醇濃度的升高能夠沉淀出的多糖分子量越來越小，當乙醇濃度達到85%時可以沉淀出單糖。

（2）采用硫酸-苯酚法對提取的多糖進行定量，多糖在硫酸作用下，水解成單糖，并迅速脫水生成糠醛衍生物，與苯酚縮合成有色化合物。用紫外分光光度法測定多糖含量。

1.2.2 試驗步驟

試驗設計思路：分別將乙醇提取濃度、冷藏溫度和水提溫度其中的一個實驗條件作為變量，保持其他實驗條件、試劑及儀器設備不變的情況下進行單因素試驗。再將影響醇沉步驟的兩個單因素變量進行正交試驗，分別找出每個試驗條件中的最佳變量，最后對研究結果進行綜合對比驗證。

操作步驟：取供試品1.0 mL，置離心式管中，加入無水乙醇至乙醇濃度80%，搖勻，冷藏1 h，取出，離心（轉速為4000 r/min）20 min，棄去上清液，加熱水1 mL 溶解即得。精確量取上述所得溶液1 mL，加入5 %苯酚溶液（臨用配制），搖勻，再加入硫酸5 mL，搖勻，至沸水浴中加熱20 min，取出，至冰浴中冷卻5 min，以相應試劑為空白，利用紫外分光光度計法在波長488 nm 處測定吸光度[1]（注：吸光度與多糖含量成正比，吸光度越高提取效果越好）。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 吸光度隨乙醇提取濃度變化

以乙醇提取濃度為變量，保持其他實驗條件不變，將乙醇提取濃度分別調節(jié)成70%、75%、80%、85%、90%5 個梯度，每組進行3 次平行測定，實驗結果如圖1。

圖1 吸光度隨乙醇提取濃度變化規(guī)律折線圖

結果顯示：當乙醇提取濃度在70%～80%范圍內，吸光度隨乙醇提取濃度的升高而升高；當乙醇提取濃度在80%～90%范圍，吸光度達到最大且趨于穩(wěn)定。

2.1.2 吸光度隨冷藏溫度變化

以冷藏溫度為變量，保持其他實驗條件不變，選取8 ℃、6 ℃、4 ℃、2 ℃、0 ℃、-2 ℃、-4 ℃共7個冷藏溫度梯度，每組進行2次平行測定，實驗結果如圖2。

圖2 吸光度隨冷藏溫度影響變化規(guī)律折線圖

結果顯示：吸光度隨冷藏溫度的降低而升高，當冷藏溫度達到0 ℃時吸光度達到最高并趨于穩(wěn)定。說明冷藏溫度在0 ℃及以下時提取效果最佳。

2.1.3 吸光度隨水提溫度變化

以水提溫度為變量，保持其他實驗條件不變，選取40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃共9 個溫度梯度，每組進行3 次平行測定，實驗結果如圖3。

圖3 吸光度隨水提溫度變化規(guī)律折線圖

結果顯示：吸光度隨水提溫度的升高而升高，當水提溫度升至70 ℃時達到最高并趨于穩(wěn)定，說明水提溫度在70 ℃及以上提取效果均較好，但是隨溫度的升高操作難度增大，綜合考慮70 ℃為最佳提取溫度。

2.2 正交試驗

以上3 個單因素條件涉及醇沉與溶解兩個步驟，影響醇沉的實驗條件為乙醇提取濃度和冷藏溫度；影響溶解的實驗條件為水提溫度，通過上述試驗可確定最佳水提溫度為70 ℃，現(xiàn)將醇沉步驟中的乙醇提取濃度和冷藏溫度兩個試驗條件進行兩因素三水平正交試驗，試驗設計如表1。

將表1中9組試驗進行每組3次平行測定，試驗結果如圖4。

圖4 乙醇提取濃度和冷藏溫度正交試驗結果對比

表1 乙醇提取濃度和冷藏溫度兩因素三水平正交試驗設計

由正交試驗結果可知：共9 組試驗數據中，第2組、第5組、第9組提取效果均較好，但第2組標準偏差較小，試驗結果準確性較高，所以第2組的試驗條件應為最佳試驗條件，即乙醇提取濃度為85%，冷藏溫度為0 ℃。

綜合單因素試驗與正交試驗可知，各試驗的標準偏差均符合標準要求，說明試驗準確可行；在醇沉步驟中配制酒多糖提取的最佳實驗條件為乙醇提取濃度85%，冷藏溫度0 ℃；在水溶提取步驟中最佳水提溫度為70 ℃。

2.3 回收率試驗

選取不含多糖的白酒樣品與多糖標準品配制成多糖含量為500 mg/L 的多糖標準溶液，分別向A、B、C、D 組加入0.5 mL、2.5 mL、5 mL、10 mL 的500 mg/L 多糖標準溶液,用上述白酒樣品定容至50 mL，配制成5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L 4 個濃度水平樣品，每個濃度水平各做6 個平行，按照上述試驗所得的最佳前處理條件進行試驗，具體試驗數據見表2。

從表2 可看出，4 個濃度水平的回收率為89.58 %～100.67 %，相對標準偏差為0.04 %～0.08%，均符合《中國藥典2015 版9101 藥品質量標準分析方法驗證指導原則》中回收率限值及準確性的要求。

表2 配制酒多糖提取方法回收率及相對標準偏差

3 結論與展望

3.1 明確了配制酒多糖檢測前處理中多糖提取的最佳實驗條件為乙醇提取濃度85 %，冷藏溫度0 ℃，水提溫度70 ℃。對配制酒中多糖提取的實驗條件進行了優(yōu)化，在一定程度上完善了配制酒中的多糖檢測方法。

3.2 從檢驗操作準確性角度考慮，明確具體的試驗條件更能夠保證檢驗結果的準確性。

3.3 隨著保健型配制酒市場的日益壯大，消費者對于配制酒中有益成分的關注也越來越高，用科學的理論與實驗方法積極完善配制酒檢測方法，規(guī)范配制酒檢測體系，是每一位檢驗工作者的責任，期待配制酒多糖檢測國家標準或行業(yè)標準的出臺。