凌峰 張勇 辛向陽(yáng)

葡萄膜黑色素瘤(UM)是成人最常見(jiàn)的原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤，惡性程度高、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差[1-2]。UM患者盡管以手術(shù)為主的綜合治療局部控制良好，但復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移仍是術(shù)后面臨的主要問(wèn)題[3]，目前轉(zhuǎn)移后治療尚無(wú)一致意見(jiàn)，且效果差。針對(duì)癌基因設(shè)計(jì)靶向藥物是治療腫瘤的重要途徑之一，因此，深入研究UM發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制、尋找新型腫瘤轉(zhuǎn)移標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)具有重要的科學(xué)意義和臨床價(jià)值。

紡錘體動(dòng)粒相關(guān)復(fù)合體-1(SKA1)是紡錘體和動(dòng)粒相關(guān)復(fù)合物(SKA)的重要組成部分(或稱亞基)，參與有絲分裂的調(diào)控。破壞SKA1的靈活性，或其微管蛋白結(jié)合位點(diǎn)，都能擾亂有絲分裂的正常進(jìn)程，使有絲分裂阻滯于分裂中期，無(wú)法進(jìn)入后期[4-5]。有文獻(xiàn)報(bào)道，SKA1在胃癌、肝細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[6-7]，然而，SKA1在UM組織及細(xì)胞中的表達(dá)、作用及分子機(jī)制目前尚不清楚。本研究首次探討了SKA1在UM發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，并通過(guò)基因表達(dá)譜芯片聯(lián)合生物信息學(xué)分析探尋SKA1的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng)A-375、MUM-2B和MUM-2C細(xì)胞株由天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院孫豐源教授惠贈(zèng)。細(xì)胞培養(yǎng)使用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)，并加入10 g·L-1青鏈霉素預(yù)防細(xì)菌污染，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中，間隔2～3 d更換培養(yǎng)基。

1.2 篩選SKA1敲減的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株重懸A-375、MUM-2B和MUM-2C細(xì)胞，細(xì)胞濃度均調(diào)整為4×104個(gè)·mL-1，各吸取2 mL細(xì)胞懸液，接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞匯合度達(dá)30%～40%時(shí)，吸去培養(yǎng)液，以2 mL含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的培養(yǎng)液稀釋慢病毒(購(gòu)自上海吉?jiǎng)P)，包括靶向SKA1敲減慢病毒[shSKA1;敲減靶點(diǎn)序列分別為5’-GGAGATGAGATCATTGTAA-3’(shSKA1-1)、5’-GGATACCAAAGGTCGTTATTT-3’(shSKA1-2)、5’-CAATGCTGCAGACCCTAATAA-3’(shSKA1-3)]以及空載體慢病毒(shCtrl)，加入助轉(zhuǎn)劑聚凝胺(Polybrene，2 g·L-1)，混勻后加入相應(yīng)孔中。感染慢病毒48～72 h后，換含嘌呤霉素(2 g·L-1)的培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選，計(jì)算細(xì)胞存活率即陽(yáng)性感染率，最終篩選出SKA1敲減的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株作為SKA1敲減組用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot檢測(cè)使用Trizol試劑分別提取A-375、MUM-2B和MUM-2C細(xì)胞總RNA，依據(jù)說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)，反應(yīng)體系：SYBR premixex Taq 6.0 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA模板1.0 μL、RNase-Free H2O 4.0 μL，以GAPDH 作為內(nèi)參，SKA1相對(duì)表達(dá)量通過(guò) 2-△△Ct或ΔCt計(jì)算獲得。

RIPA細(xì)胞裂解液提取SKA1敲減組、對(duì)照組(轉(zhuǎn)染shCtrl)的MUM-2B細(xì)胞總蛋白，以BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取30 μg總蛋白上樣于SDS-PAGE凝膠，電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，分別與SKA1抗體(11000，北京博奧森)和GAPDH(1500，Santa Cruz Biotechnology公司，美國(guó))4 ℃孵育過(guò)夜，漂洗后與HRP標(biāo)記的二抗(12000，Santa Cruz Biotechnology公司，美國(guó))室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光試劑顯影，然后采用Quantity one掃描軟件分析。

1.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKA1敲減組和對(duì)照組MUM-2B細(xì)胞，于96孔板中按每孔3000個(gè)細(xì)胞鋪板，在培養(yǎng)后不同時(shí)間點(diǎn)(1 d、2 d、3 d、4 d、5 d)加入20 μL 5 g·L-1的MTT試劑于孔中，反應(yīng)4 h，持續(xù)振蕩6 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm/570 nm處光密度。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡慢病毒轉(zhuǎn)染MUM-2B細(xì)胞48 h后，用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化離心SKA1敲減組和對(duì)照組MUM-2B細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為2×104個(gè)·mL-1。800 r·min-1離心5 min，棄上清，加5 mL PBS重懸細(xì)胞，重復(fù)2次后離心，棄上清，最后重懸細(xì)胞于0.5 mL PBS中。用低速振蕩器邊振蕩邊加入5 mL預(yù)冷的含體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，4 ℃過(guò)夜。第二日將固定好的細(xì)胞以1000 r·min-1離心5 min，棄上清，PBS清洗后重懸細(xì)胞。加入5 μL(10 g·L-1)的RNaseA，37 ℃消化1 h，加入終濃度50 g·L-1碘化丙啶，4 ℃避光染色過(guò)夜，使用流式細(xì)胞儀分析軟件Guava InCyte分析。

1.6 Caspase-3/7法檢測(cè)細(xì)胞凋亡SKA1敲減組、對(duì)照組細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞加入96孔板，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)2 d，每孔中加入Caspase-Glo反應(yīng)液100 μL，500 r·min-1離心30 min，再室溫孵育 1 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)儀器測(cè)定信號(hào)強(qiáng)度。

1.7 基因表達(dá)譜芯片分析提取SKA1敲減組和對(duì)照組MUB-2B細(xì)胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行表達(dá)譜芯片檢測(cè)。再采用R limma包篩選差異表達(dá)基因，并對(duì)差異基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)和KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，初步探索SKA1促進(jìn)UM細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

1.8 SKA1生存分析從TCGA GDC網(wǎng)站(https://portal.gdc.cancer.gov/)分別下載UM轉(zhuǎn)錄組、臨床數(shù)據(jù)文件，利用定制化perl腳本將下載的UM樣本文件整理成基因轉(zhuǎn)錄組矩陣文件、臨床文件；再將轉(zhuǎn)錄組、臨床文件合并，采用R“survminer”和“survival”包，繪制Kaplan-Meier生存曲線圖。依據(jù)SKA1表達(dá)中位值將UM樣本分為SKA1高、低表達(dá)組，利用基因集富集分析(Gene set enrichment analysis)軟件，解析與SKA1表達(dá)水平與各信號(hào)通路狀態(tài)(激活、抑制或無(wú)變化)的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 SKA1敲減序列的篩選以qRT-PCR檢測(cè)SKA1在不同黑色素瘤細(xì)胞株中的表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量以-ΔCt表示，結(jié)果顯示，SKA1在A-375、MUM-2B和MUM-2C細(xì)胞株的表達(dá)豐度均高(圖1A)，但在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，A-375、MUM-2C生長(zhǎng)狀態(tài)差，經(jīng)檢驗(yàn)為支原體污染，遂采用MUM-2B細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR檢測(cè)MUM-2B各處理組SKA1表達(dá)，結(jié)果顯示，與shCtrl組相比，SKA1敲減組表達(dá)顯著降低(P<0.01)，shSKA1-1、shSKA1-2、shSKA1-3各敲減組的敲減效率分別為78.86%、62.71%、57.83%。因此，shSKA1-1用于后續(xù)細(xì)胞表型功能實(shí)驗(yàn)(圖1B)。

圖1 SKA1在三種細(xì)胞株的表達(dá)豐度及靶向SKA1敲減序列的篩選 A：SKA1在三種細(xì)胞株中的表達(dá)豐度；B：SKA1不同敲減靶點(diǎn)的敲減率(**P<0.01)。

2.2 SKA1對(duì)MUM-2B細(xì)胞增殖的影響MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組MUM-2B細(xì)胞培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d時(shí)光密度分別為0.20±0.00、0.36±0.01、0.61±0.02、0.98±0.02、1.25±0.03；SKA1敲減組MUM-2B細(xì)胞培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d 時(shí)光密度分別為0.15±0.00、0.20±0.04、0.25±0.02、0.37±0.01、0.41±0.05；與對(duì)照組相比，SKA1敲減組MUM-2B細(xì)胞培養(yǎng)3 d、4 d、5 d 的光密度均顯著降低(均為P<0.01)，說(shuō)明SKA1敲減后MUM-2B細(xì)胞增殖活性被顯著抑制(圖2)。

圖2 對(duì)照組、SKA1敲減組MUM-2B細(xì)胞MTT生長(zhǎng)曲線 注：與對(duì)照組比較，**P<0.01，***P<0.001。

2.3 SKA1對(duì)MUM-2B細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為5.30%±0.45%，SKA1敲減組細(xì)胞凋亡率為12.63%±0.04%，SKA1敲減組細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。采用Caspase-3/7法檢測(cè)Caspase-3/7活性，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SKA1敲減組細(xì)胞Caspase-3/7活性顯著增強(qiáng)(P<0.001)，與流式細(xì)胞儀檢測(cè)的細(xì)胞凋亡情況一致(圖3)。

圖3 對(duì)照組、SKA1敲減組MUM-2B細(xì)胞凋亡比例圖 A：對(duì)照組細(xì)胞流式凋亡圖；B：SKA1敲減組細(xì)胞流式凋亡圖；C：兩組細(xì)胞凋亡統(tǒng)計(jì)圖；D：兩組細(xì)胞Caspase-3/7熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖。注：**P<0.01，***P<0.001。

2.4 SKA1促進(jìn)UM細(xì)胞增殖的分子機(jī)制分別提取對(duì)照組和SKA1敲減組MUM-2B細(xì)胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)(圖4)。采用R“l(fā)imma”包篩選差異表達(dá)基因，共篩選出差異表達(dá)基因362個(gè)，其中高表達(dá)176個(gè)，低表達(dá)186個(gè)，高、低表達(dá)組分別選取差異最顯著的前15個(gè)基因，以熱圖展示(圖4A)；并對(duì)所有基因及后續(xù)富集通路中的基因以火山圖展示(圖4B)。經(jīng)GO和KEGG通路富集分析顯示，362個(gè)差異基因顯著富集于P53

圖4 SKA1敲減組、對(duì)照組全基因表達(dá)譜測(cè)序熱圖、火山圖、富集分析柱狀圖以及相應(yīng)細(xì)胞Western blot圖 A：高、低表達(dá)組中差異最顯著的前15個(gè)基因的熱圖; B：全部基因包含P53信號(hào)通路8個(gè)差異基因的火山圖； C：差異基因GO柱狀圖; D：差異基因KEGG富集分析柱狀圖;E：各組IGFBP-3表達(dá)Western blot圖。

信號(hào)通路(圖4C、圖4D)，富集在此通路的基因包括胰島素樣生子因子結(jié)合蛋白-3(IGFBP3)、SESN2、TNFRSF10B、CCNG1、CD82、ATR、CCNE、RCHY1。為驗(yàn)證生物信息學(xué)的分析結(jié)果，分別提取SKA1敲減組及對(duì)照組細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示(圖4E)，SKA1敲減組IGFBP3表達(dá)下調(diào)，提示SKA1通過(guò)負(fù)調(diào)控IGFBP3抑制P53信號(hào)通路，從而促進(jìn)UM細(xì)胞的增殖。

2.5 SKA1的高、低相對(duì)表達(dá)對(duì)UM患者生存期的影響將TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)UM樣本按SKA1表達(dá)(FPKM)最佳界值(Best cutoff=0.64)分為高、低表達(dá)患者，繪制Kaplan-Meier生存曲線，結(jié)果顯示，SKA1高表達(dá)患者生存率顯著下降(P<0.05；HR=2.55,95%CI:0.92～7.05)(圖5)。

圖5 SKA1的不同表達(dá)水平在UM患者中Kaplan-Meier生存曲線圖

3 討論

UM是成人最常見(jiàn)的眼內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，對(duì)于高?；颊?，可采用的有效治療方案不足1%[8]，手術(shù)患者約50%以上出現(xiàn)血行轉(zhuǎn)移，大部分累及肝臟，最終致肝衰竭而死亡。手術(shù)切除既沒(méi)明顯改善患者的生活質(zhì)量，又沒(méi)達(dá)到根治腫瘤的效果。因此，深入研究UM發(fā)生及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制、尋找腫瘤分子標(biāo)志物及治療新靶點(diǎn)具有重要意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。

有文獻(xiàn)報(bào)道，SKA1參與胃癌、肝細(xì)胞癌、口腔鱗癌、涎腺腺樣囊性癌、非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、甲狀腺乳頭狀癌、骨肉瘤等惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移[9-14]。然而，SKA1在UM發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用及分子機(jī)制目前尚不清楚。本研究首次發(fā)現(xiàn)SKA1通過(guò)P53/IGFBP3促進(jìn)UM細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

SKA1介導(dǎo)的信號(hào)通路在不同腫瘤中影響不同表型。Li等[15]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SKA1除了在有絲分裂中富集于紡錘體微管和動(dòng)粒外層，也會(huì)在培養(yǎng)細(xì)胞的中心體富集。在SKA1轉(zhuǎn)基因裸鼠中，敲除SKA1導(dǎo)致中心體復(fù)制障礙，而SKA1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致前列腺上皮細(xì)胞的中心體過(guò)度擴(kuò)增，出現(xiàn)多個(gè)中心體，導(dǎo)致裸鼠的腫瘤發(fā)生概率增高。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)，SKA1敲減后，口腔鱗狀細(xì)胞癌CAL-27細(xì)胞的增殖、克隆形成能力下降，凋亡增加，細(xì)胞周期被阻滯于G2/M期。Shi等[17]研究發(fā)現(xiàn)，SKA1敲減后，A172、U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力減弱等。為進(jìn)一步研究SKA1在UM的發(fā)生發(fā)展中是否發(fā)揮了促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的作用，我們利用qRT-PCR 檢測(cè)三種UM細(xì)胞株中SKA1表達(dá)，并篩選出最有效的敲減序列shSKA1，用于后續(xù)的MTT實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞技術(shù)、Caspase-3/7法檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲減了SKA1的MUM-2B細(xì)胞增殖活性顯著低于對(duì)照組，而細(xì)胞凋亡速度顯著高于對(duì)照組。間接證明了SKA1在UM的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促進(jìn)增殖、抑制凋亡的作用，這與其他文獻(xiàn)[16-17]所報(bào)道結(jié)果相一致。

IGFBP3是胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFs)系統(tǒng)中的六種高親和力蛋白IGFBPs中作用最主要的調(diào)節(jié)蛋白，其主要功能是結(jié)合循環(huán)中的IGFs，從而控制它們的生物利用率[18]。研究發(fā)現(xiàn)，IGFBP3可以通過(guò)控制IGFs對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGF1R)的作用，從而發(fā)揮其抑制增殖和抗凋亡的作用[19]。Yang等[20]在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均證實(shí)，IGFBP3的過(guò)表達(dá)均能抑制膠質(zhì)細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞增殖，進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)。有研究表明，IGFBP3是P53調(diào)控的靶基因，其表達(dá)隨野生型P53的增加而增加，并與IGFBP3啟動(dòng)子中的DNA反應(yīng)元件結(jié)合[21]。P53誘導(dǎo)IGFBP3表達(dá)已被證明與細(xì)胞凋亡增加和增殖減少有關(guān)[22]。這些都證明 IGFBP3 蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮抑癌基因的作用。為探索SKA1影響UM的潛在通路，我們利用KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，SKA1可能通過(guò)P53信號(hào)通路發(fā)揮作用， Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，SKA1敲減后P53通路中關(guān)鍵分子IGFBP3表達(dá)隨之下降，提示SKA1可能通過(guò)P53/IGFBP3 來(lái)影響UM細(xì)胞的增殖及凋亡。

同時(shí)，我們還分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)UM樣本中SKA1表達(dá)與臨床及預(yù)后的相關(guān)性。由于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)沒(méi)有UM癌旁正常組織，我們分析SKA1的表達(dá)差異，只能分析其與臨床及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，SKA1高表達(dá)的患者總生存率明顯降低，這與Dong等[23]提出的SKA1是影響甲狀腺乳頭狀癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素一致。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SKA1是影響UM預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，通過(guò)P53/IGFBP3信號(hào)通路促進(jìn)UM細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。因此，SKA1增殖可能成為UM分子治療的潛在靶點(diǎn)，然而，SKA1直接作用機(jī)制，包括與SKA1結(jié)合的上、下游蛋白分子及功能域尚不明確，有待進(jìn)一步研究。